范美霞 徐传霞 李俊菊 蔡丽沙 冯庆文
摘 要：产漆酶菌株与焦性没食子酸反应能产生棕褐色的变色圈，根据这一原理，从土壤中筛选出一株高产漆酶的菌株，并初步研究了温度对漆酶活性的影响，结果表明50～60 ℃为其活性最强的温度范围。
关键词：漆酶;Bavendamm培养基;变色圈;真菌
Abstract：Lacese-Produeing microbial stains react with Bavendamm， the response generated with brown， Through this principle， a strain screened from soil strains of high yield of laccase， and a preliminary study of temperature effect on the laccase activity， the results show that between 50～60 ℃ temperature of its most active.
Key words：Laccase; Bavendamms medium; Color changing ring; Fungi
中图分类号：Q93
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，最早发现于日本漆树的伤流液，广泛存在于昆虫、植物、真菌和细菌中[1-4]。漆酶能氧化各种酚类化合物、杀虫剂等多种环境污染物，因而被广泛应用于造纸、印染、食品等工业。也正是因为漆酶酶的应用价值，故对该酶高产菌的分离筛选成为目前的研究热点。从现有报道看，漆酶最主要来源于子囊菌和担子菌亚门的高等真菌，特别是担子菌中的白腐真菌[5]，这些菌也是目前报道最有效的芳香族类化合物的降解菌。但白腐菌一般生长周期长，而且所产漆酶大多为诱导酶[6]，这些特性使工业生产难以有效进行，故筛选生长周期短、产酶时间早的菌株具有十分重要的意义。由于漆酶应用广泛，高酶活菌株的筛选就显得尤其重要。但目前，对漆酶菌株的筛选尚无简便可靠的方法，用液体发酵进行初筛既费时又费力;用木质素降解菌的筛选方法，往往针对性较差，效果也不理想。为了寻找漆酶产生菌的初筛条件，笔者根据不同温度对漆酶活性的影响，进行了漆酶产生菌株初筛条件的研究，结果大大提高了初筛的工作效率，现将报告如下。
1 实验原理
Bavendamm平板法是通用的漆酶产生菌初筛方法，其原理是利用菌株分泌的漆酶能使Bavendamm平板中的鞣酸等酚类化合物聚合因而在菌落周围形成棕褐色轮环显色圈的性质，根据显色圈的直径大小和产生时间可判断其产漆酶性能。
2 材料与方法
2.1 实验样品
（1）土壤采样。采集带有腐烂杨树叶的底下
5～15 cm深的土壤，三点采集，每份样品重约5 g，编号样品1～7。
（2）從杨木堆中分离筛选。取感染有真菌的木头，用小刀撬取一小块接种在选择培养基平板上，取3份样品，编号样品8～10。
2.2 培养基
（1）PDA培养基。马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉18 g、KH2PO4 3 g、MgSO4·7H2O 1.5 g，pH自然（约6.0），加水至1 000 mL，121 ℃灭菌20 min。倒平板后备用。
（2）Bavendamm培养基。马铃薯培养基中加入终浓度为0.03%的焦性没石子酸（鞣酸）。
2.3 试验步骤
2.3.1 产漆酶菌株的初选
（1）在无菌环境下将样品1～7研碎，10倍稀释成不同浓度的样液。吸取各梯度样品悬液0.1 mL，均匀涂布于Bavendamm培养基上，每浓度设2个重复，置于28 ℃恒温培养，每24 h观察一次，选出平板上出现明显棕褐色变色圈的单菌落菌株，有棕褐色轮环者记为+，反之记为-，根据所产褐色圈的大小，选出产漆酶能力强的微生物菌株，并记录显色时间[6-8]。
（2）在无菌条件下将样品8～10研碎，均匀地晒在Bavendamm培养基上，每个样品设2个重复，置于28 ℃恒温培养，每24 h观察一次，选平板上出现明显褐色变色圈的单菌落菌株。记录菌落周围有无褐色轮环产生，有棕褐色轮环者记为+，反之记为-，根据所产褐色圈的大小，选出产漆酶能力强的微生物菌株，并记录显色时间[6-8]。
2.3.2 产漆酶菌株的复筛
复筛漆酶活性的检测可根据Bavendamm的方法进行，由于培养基中加入一定量的愈创木酚，含有漆酶的菌株在这特定培养基上长出的菌丝能产生明显的橘红色。用Bavendamm方法能判断菌株有无漆酶，而且根据变色圈颜色深浅能大致分析出试验菌株含有漆酶活力高低。对培养过程中每天变色圈和菌丝圈尺寸大小和变色圈颜色深浅变化进行分析，筛选出1株产漆酶较高的菌株，编号为菌株1，此菌株作为进一步研究的试验菌株。
挑选出现棕褐色变色圈的单菌落进行打孔，使用直径5 mm的打孔器。将打孔下来的菌片接种到PDA培养基上的菌株置于28 ℃的恒温箱中进行培养，待菌落长到直径5 cm左右进行打孔转接。
2.3.3 产漆酶菌株的鉴定
将上步的菌株打孔转接到马铃薯培养基上，至于28 ℃恒温培养。在打孔过的平板的孔隙内加入0.1%的焦性没食子酸溶液，置于28 ℃恒温箱中，每12 h观察平板底部颜色的变化。将棕褐色变化最深的菌株打孔10份，编号为1-1、1-2、2-1、2-2、3-1、3-2、4-1、4-2，5-1，5-2，接种到马铃薯培养基上。置于28 ℃中培养。然后挑取在PDA平板上的菌丝制成菌悬液，于显微镜下观察其菌丝形态。
2.3.4 产漆酶速度的鉴定
待菌落的直径长到5 cm左右时，对培养基打孔，在打孔的培养基的孔隙中滴入4滴0.1%的焦性没食子酸溶液，分别放入28、37、50、60 ℃培养箱中培养，每隔30 min进行观察。寻找最先出现棕褐色变化的样品，并记录产生棕褐色的时间。
3 结果与分析
3.1 初筛结果
在10个采集的试验样品中，有3个样品疑似含有产漆酶菌株，并且菌落的大小都不相同，菌落的颜色为棕红色，对疑似区域用小号打孔器进行打孔转接到马铃薯培养基上。对采集的样品培养72 h后观察结果如表l表示，变色圈形态如图1所示。
3.2 复筛结果
将打孔的菌落接种在马铃薯培养基上，在28 ℃恒温培养后72 h较大的单菌落，对菌落打孔转接后置于28 ℃中，在孔隙中加入4滴0.1%的焦性没食子酸溶液，24 h观察结果，发现有3株菌落有棕褐色变化，并且颜色变化不同，结果如图2所示。
3.3 漆酶菌株的形态鉴定
经显微镜检测，该菌菌丝体为丝状，具有隔膜，有锁状联合，细胞为多核结构，符合漆酶的特征（图略）。
3.4 产漆酶菌株的快速筛选
将培养的平板打孔，每个孔隙中加入4滴0.1%焦性没食子酸溶液，分别置于28、37、50、60 ℃的环境中恒温培养，每间隔30 min观察一次。结果发现，50 ℃最先出现颜色变化，其次是60 ℃，最后是37 ℃和28 ℃。表明漆酶的最适温度在50～60 ℃。在50 ℃反应4 h，结果如图3所示。
4 结论
通过平板显色法从土壤中筛选出一株高产漆酶的菌株，并初步研究了温度对漆酶活性的影响，初步测得该菌株所分泌的漆酶发挥活性的最适温度在50～60 ℃，对于该酶有关理化性质还在进一步的研究中。
参考文献：
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