刘影 甘钊生 张榕欣
摘 要：采用柚苷酶对橘红进行脱苦研究。以橘红脱苦率为指标，在单因素试验的基础上，采用响应面法优化柚皮苷酶对橘红的脱苦工艺，确定最佳脱苦条件为：酶解温度60 ℃、酶解时间2 h、酶用量为0.8%、pH值为4～5，在此条件下脱苦率可达25.1%。
关键词：橘红;柚皮苷酶;脱苦;响应面法
Abstract：Pummelo Peel was debitterized by naringinase treatment. The response surface method was used for optimizing the conditions of debitterizing based on single factor experiment with the index of debitterizing rate. The results showed that the optimum conditions were as follows： enzyme treatment temperature was 60 ℃， enzyme treatment time was 2 h， enzyme dosage 0.8%， soaking solution pH was 4～5. Under this condition， the debitterizing rate reached 25.1%.
Key words：Pummelo peel; Naringinase; Debitterize; Response surface method
中图分类号：R284.2
橘红自古被称为南方人参，是中国四大南药和十大广药之一。《本草纲目拾遗》记载，橘红治痰症、消油腻、消食、醒酒、宽中、解蟹毒。橘红目前主要被加工为橘红片、橘红成药、橘红制剂等药品。橘红属药食同源物品，既可作为药材也可作为食品，但橘红苦味强烈，很难将其加工为口感被大众喜爱的食品。
黄酮类成分是橘红的主要有效成分之一[1]，其中柚皮苷占总黄酮含量的80%以上[2]，可达到橘红重量的7.87%[3]，柚皮苷苦感强烈，在水里的苦味阈值为20 mg·L-1[4]。柚皮苷的去除方法主要有吸附法、屏蔽法、酶法等，其中酶法脱苦专一性强，是较为理想的脱苦方法[5]。目前已有关于柚苷酶对柚子汁、柚子皮、柑橘果汁、金桔汁等的脱苦研究，暂未见橘红的脱苦研究。本研究首次利用柚皮苷酶对橘红进行脱苦，并通过响应面法优化脱苦工艺，以期将橘红开发为口感接受度高的食品，从而推动橘红产业的进一步发展。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
材料。橘红，采摘于广东省化州市;柚皮苷标准品，购自sigma公司;柚皮苷酶（食品级），购自上海瑞丰实业有限公司;柠檬酸、二甘醇、氢氧化钠等试剂均为分析纯。
仪器。高速万能粉碎机（型号：FW-100，天津市泰斯特仪器有限公司）;数显恒温水浴锅（型号：DK-98-IIA，天津市泰斯特仪器有限公司）;电子天平[型号：ME-104，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司];紫外可见分光光度计（型号：UV-1800PC，上海美谱达仪器有限公司）;pH计（型号：pHS-3C，上海精密雷磁公司）。
1.2 橘红脱苦干燥处理
新鲜橘红于沸水中烫漂2～3 min，切成长20～30 mm、宽5～10 mm、厚1.0～2.0 mm片状，加入一定浓度的柚苷酶溶液，在一定温度和pH条件下脱苦一定时间，漂洗10 min，沥干水分，在70 ℃恒温鼓风条件下烘干8 h，粉碎，过100目筛，待用。
1.3 柚皮苷含量测定
采用Davis[6-7]法对橘红中柚皮苷含量进行测定。
1.3.1 绘制标准曲线
称取干燥至恒重的柚皮苷标样100.0 mg，添加0.1 mol·L-1的NaOH使其完全溶解，用柠檬酸调节pH值到6，定容至250 mL，得到柚皮苷标准储备液。将标准储备液稀释5倍得到溶度0.08 mg·mL-1的标准使用液，同时以空白液作标准稀释用。分别吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0 mL和5.0 mL标准使用液于6支具塞试管中，分别添加空白液5.0、4.0、3.0、2.0、1.0 mL和0.0 mL，各加入90%二甘醇5.0 mL和4 mol·L-1
NaOH溶液0.1 mL，置于40 ℃水浴中显色10 min，立即在420 nm波长下测量吸光度。以柚皮苷含量为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，得到标准曲线方程为Y=3.127 9X+0.005 1，R?=0.997。
1.3.2 样品测定
①取一定量橘红粉末，加入0.1 mol·L-1NaOH溶液50 mL，用4 mol·L-1 NaOH溶液调节pH至12，浸泡30 min，用柠檬酸溶液调节pH至6，定容到250 mL。
过滤，收集澄清液，备用。②分别移取样液0.50 mL于2支具塞试管，加试剂空白液至5 mL，分别加90%二甘醇5 mL，各加4 mol·L-1NaOH溶液0.0 mL和0.1 mL，置于40 ℃水浴中显色10 min，立即在420 nm
波长处测量吸光度，用加碱管的吸光值减去不加碱管的吸光值，通过标准曲线回归方程算出所取样液中柚皮苷含量毫克数。
1.3.3 橘红中柚皮苷含量
（1）
式（1）中：A-由待测液吸光值通过标准曲线计算所得的柚皮苷含量，单位mg;V1-样品测定时定容的总体积，单位mL;V2-移取的待测液体积，单位mL;m-样品称取的质量，单位g。
1.3.4 脱苦率计算
脱苦率以水解柚皮苷的程度表示。
1.4 单因素试验
以橘红脱苦率为考查对象，选取柚苷酶的用量、酶解的温度、酶解的时间和酶解的pH4个影响柚苷酶脱苦效果的主要因素进行单因素试验研究。
1.5 响应面试验
在单因素试验的基础上，结合实际试验操作，选取酶解温度（A）、酶解时间（B）和酶用量（C）对脱苦率影响较大的3个因素为进一步研究对象，根据Box-Behnken中心组合实验原理，设计三因素三水平的响应面分析试验方案，试验方案见表1。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 酶解温度对脱苦效果的影响
各称取烫漂切片的橘红100 g，在pH值4.0的溶液中加入0.6%的柚苷酶，分别于30、40、50、60 ℃和70 ℃条件下脱苦1.0 h，测定反应温度对脱苦率的影响。由图1可知，柚皮苷酶的脱苦效果受温度的影响较大，在30～60 ℃温度范围内，随着温度的升高柚皮苷酶对橘红的脱苦效果明显上升，当温度超过60 ℃
后，脱苦效果随着温度的升高反而降低，说明温度过低，酶活力低会降低对橘红的脱苦效果;温度过高，酶蛋白会发生变性，影响酶活力，也会降低脱苦效果[8-9]。
试验结果表明脱苦的适合温度范围为50～65 ℃，此时脱苦效果较好。
图1 酶解温度对橘红脱苦率的影响图
2.1.2 酶解时间对脱苦效果的影响
各称取烫漂切片的橘红100 g，在pH值4.0的溶液中加入0.6%的柚苷酶，于50 ℃条件下分别脱苦0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h和3.0 h，测定反应时间对脱苦率的影响。由图2可知，在其他条件一定的情况下，随着酶作用时间的增加，脱苦率逐渐增大，在2 h前上升较快，2 h后的上升速率明显下降，2.5 h后幅度基本保持不变，可能是因为在酶解反应前期，柚皮苷底物含量高，酶解速率高，随着时间的延长柚苷酶发生变性，酶解反应几乎停止，因此脱苦率基本保持不變[10-11]。为提高生产效率，在保证脱苦率的前提下，酶解时间应越短越好。试验结果表明脱苦时间以2 h为佳。
图2 酶解时间对橘红脱苦率的影响图
2.1.3 酶添加量对脱苦效果的影响
各称取烫漂切片的橘红100 g，在pH值4.0的溶液中分别添加0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.2%、1.6%和2.0%的柚苷酶，于50 ℃条件下脱苦1.0 h，测定酶添加量对脱苦率的影响。由图3知，脱苦率随着酶添加量的增加先升高后降低，在添加0.8%的柚苷酶时脱苦率达到最大值，可能是由于当酶浓度较低时，酶解反应与酶的浓度成正比。当酶浓度过高时，底物浓度相对较低，酶与底物接触机会下降，同时存在竞争性抑制作用，导致脱苦率降低[9-10]。综合考虑，酶用量为0.6%～1.0%范围内脱苦效率较好。
图3 酶添加量对橘红脱苦率的影响图
2.1.4 酶解pH对脱苦效果的影响
各称取烫漂切片的橘红100 g，分别在pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的溶液中添加0.6%的柚苷酶，于50 ℃条件下脱苦1.0 h，测定溶液pH值对脱苦率的影响。由图4知，用柚皮苷酶对橘红进行脱苦，当溶液的pH值在4以下时，随着pH值的增加脱苦率明显增大;当溶液的pH值在5以上时，随着pH值的增加脱苦率降低;溶液pH值在4～5时脱苦率较高且比较稳定。说明酶对底物进行作用时，有其适宜的pH值范围，若不在酶作用的最适pH值范围，酶本身的活性将受到影响，发挥不了对底物应有的作用[11]。因此用柚皮苷酶对橘红进行脱苦时，pH值在4～5的范围内，效果较好。
图4 酶解pH对橘红脱苦率的影响图
2.2 响应面试验
2.2.1 响应面试验方案及结果
以橘红脱苦率为考查指标，通过Design Expert软件进行响应面试验设计，共有17个试验方案，其中12个试验为析因试验，5个试验为中心试验用来估算误差。试验方案及结果如表2所示。
2.2.2 回归方程的建立及方差分析
运用Design Expert软件对表2试验结果进行多元回归拟合，建立二次多项式回归模型。以橘红脱苦率（Y）为目标函数的回归方程为：
Y=24.38+0.62A+0.38B+0.23C-0.57BC-0.60A2-0.65B2-0.31C2
通过方差分析和相关系数可考察模型的可靠性，结果见表3。
模型的P值<0.000 1，表明二次方程拟合显著。失拟项P值0.528 5>0.05，表明失拟项相对于绝对误差不显著。模型的决定系数R2=0.939 6，说明模型的响应值，即橘红脱苦率变化的93.96%来源于所选变量，即柚苷酶用量、酶解时间和酶解温度。因此，此模型与试验数据拟合程度和可信度较高，可利用此回归方程确定橘红的最佳脱苦工艺条件。
回归方程方差分析中各变量的P值表明：一次项A，一次项B，交互项BC，二次项A2和B2对橘红脱苦率（Y值）的影响极显著（P<0.01），一次项C和二次项C2对橘红脱苦率（Y值）的影响显著（P<0.05）。说明各个试验因素对橘红脱苦率的影响不是简单的线性关系。3个影响因素中，对橘红脱苦率影响最大的为酶解温度，其次为酶解时间，影响最小的为酶添加量。
2.2.3 响应面分析
各试验因素的交互作用对橘红脱苦率（Y值）的影响如图5、图6、图7所示。由图5可知，橘红脱苦率随着各因素水平的增大先增大后减小。由等值线图可知，拟合面脱苦率存在最高值，说明各因素都有一个对应的最适值存在。
其中，图7的响应面较陡峭，说明酶解时间和酶添加量二者间的交互作用是极显著的。而图5和图6的响应面较缓，说明酶解温度和酶添加量、酶解温度和酶解时间的交互作用对脱苦率的影响相对较小，符合方差分析的结果。
2.2.4 橘紅脱苦工艺的确定与验证
通过回归方程预测出橘红脱苦的最佳工艺条件为柚苷酶用量0.832%，酶解时间2.11 h，酶解温度61.325 ℃。在此条件下，脱苦率在理论上可达到24.6 %。
为方便实际操作，对预测得到的理论条件进行微调，即：酶解温度为60 ℃，酶解时间为2 h，酶用量为0.8%。在此条件下重复3次脱苦试验以验证模型的有效性。3次试验的平均脱苦率为25.1%，与预测值24.6%相比，其相对误差为2.0%。说明采用响应面试验得到的柚皮苷酶对橘红脱苦的工艺参数是可靠的，具有一定的实际价值。
3 结论
采用柚皮苷酶对橘红进行脱苦，根据单因素试验的结果，以酶添加量、酶解时间、酶解温度为自变量，以橘红脱苦率为响应值，通过响应面法优化橘红酶法脱苦最佳工艺条件为酶解温度60 ℃、酶解时间为2 h、酶用量为0.8%，在此条件下脱苦率可达25.1%。
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