管庆霞 张悦 邹淑君 孙爽 于欣 张伟兵 华晓丹 杨志欣 李秀岩 王艳宏
摘要：目的 制备马钱子碱纳米结构脂质载体，对其进行表征，并探讨其体外释药规律。方法 采用溶剂乳化超声法制备马钱子碱纳米结构脂质载体。透射电镜观察其微观形态;Malvem激光粒度分析仪测定其粒径、Zeta电位及多分散指数（PDI）;差热分析法分析马钱子碱在载体中的存在形态;动态膜透析法研究马钱子碱纳米结构脂质载体的体外释放行为，采用HPLC测定马钱子碱含量，比较马钱子碱溶液与马钱子碱纳米结构脂质载体84 h内的累积释放度，并考察马钱子碱纳米结构脂质载体的释药机制。结果 马钱子碱纳米结构脂质载体透射电镜下为完整的类球形实体粒子;粒径为（137.20±1.11）nm，PDI为0.14±0.05，Zeta电位为（-34.40±0.32）mV;差热分析结果表明马钱子碱以分子态或不定形状态存在于载体中;体外释药曲线符合Higuchi方程（R2=0.965 9），药物释放量于60 h趋于饱和，累积释放量接近87%。结论 马钱子碱纳米结构脂质载体制剂学性质良好，且与马钱子碱溶液相比具有明显的体外缓释作用。
关键词：马钱子碱;纳米结构脂质载体;动态膜透析法;体外释放;高效液相色谱法
中图分类号：R283.5;R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2019）08-0066-05
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.08.014 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Abstract： Objective To prepare Brucine nanostructure lipid carrier （NLC）; To characterize Brucine NLC; To study in vitro release characteristics of Brucine NLC. Methods Ultrasound emulsification solvent method was used to prepare the Brucine NLC. The microscopic morphology was observed by transmission electron microscopy; the particle size， Zeta potential and polydispersity index （PDI） were measured by Malvem laser particle size analyzer; DTA was used to analyze the presence of Brucine in the carrier; dynamic dialysis method was used to conduct the study on in vitro release of Brucine NLC. HPLC was used to determine the content of Brucine. Accumulative release rates of Brucine solution and Brucine NLC within 84 h were compared， and the drug release behaviors of Brucine NLC were investigated. Results Brucine NLC was observed under transmission electron microscopy as a complete spheroidal solid particle. The average particle size was （137.20±1.11） nm; PDI was 0.14±0.05; Zeta potential was （-34.40±0.32） mV. DTA results showed that Brucine existed as molecular or amorphous state in the NLC; the release curve of lyophilized powder was Higuchi equation （R2=0.965 9）; cumulative release was almost saturated within 60 hours; the cumulative release percentage was nearly 87%. Conclusion Brucine NLC has good formulation properties， and has a significant in vitro sustained release effect compared with Brucine solution.
Keywords： Brucine; nanostructure lipid carrier; dynamic membrane dialyse method; in vitro release; HPLC
馬钱子为马钱科植物马钱Strychnos nux-vomica L.的干燥成熟种子，马钱子碱为其有效化学物质，同时也是毒性成分，是一种呈弱酸性的吲哚类生物碱[1]。马钱子碱具有抗炎、镇痛、抗肿瘤及增强机体免疫力等作用[2-3]，是一种高效的抗肿瘤单体，但因水溶性差、具有毒性等缺点[4-5]，制约其临床应用。如何将药物导向于肝，使其更好地服务于临床，已成为目前亟需攻克的难题。纳米结构脂质载体（nanostructure lipid carrier，NLC）是为了克服固体脂质纳米粒的不足，采用纳米技术对其进行修饰而开发的一种可负载活性成分的新型载体系统，具有毒性低、可控释药物、靶向性好、载药量大、避免药物降解与泄漏等特点[6-8]。其包载药物后经静脉注射入血，能够将包载的药物浓集于肝、脾，降低药物在其他组织中的分布。本课题组前期已经成功制备了马钱子碱NLC[9]，本研究在此基础上对其制剂学性质进行研究。
1 仪器与试药
Waters e2695-2698高效液相色谱系统（美国Waters公司），AB265-S分析电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司），Autotune高强度超声波细胞破碎仪（美国SONICS公司），DF-101Z恒温磁力搅拌器（郑州长城科工贸有限公司），Zetasizer Nano-ZS90激光粒度分析仪（英国马尔文仪器有限公司），SB-5200D超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司），WTC-1D/2D微机差热天平（北京博飞仪器有限公司），Tecnai高分辨型透射电子显微镜（荷兰飞利浦公司），HZS-HA水浴振荡器（哈尔滨东联电子技术开发有限公司），透析袋（MW 8000～14 400，美国Sigma公司）。
马钱子碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号110706-200505，纯度≥98%），马钱子碱原料药（日本和光纯药株式会社，批号059-17，纯度≥98%），泊洛沙姆188（德国BASF公司，批号WOPG565B），磷钨酸（天津致远化学试剂有限公司），Sephadex G-50葡聚糖凝胶（50～150 μm，上海浩然生物技术有限公司）;甲醇为色谱纯，单硬脂酸甘油酯、油酸、无水乙醇等为分析纯，水为蒸馏水。
2 方法与结果
2.1 纳米结构脂质载体制备
称取单硬脂酸甘油酯30 mg、油酸25 mg，置于烧杯中，加入无水乙醇2 mL，于60 ℃水浴条件下使其完全溶解，在恒温磁力搅拌作用下加入马钱子碱对照品1.28 mg，混匀，作为油相;量取浓度为1%的泊洛沙姆188 20 mL至另一烧杯中，于恒温水浴中加热到60 ℃，作为水相;将油相在60 ℃恒温磁力搅拌作用下缓缓滴加到水相中，滴加完毕后，超声3 min（功率750 W，频率20 kHz），继续室温搅拌45 min，挥去无水乙醇，即得马钱子碱NLC混悬液。
同时，以相同方法制备不含马钱子碱的空白NLC混悬液。
2.2 形态学观察
取适量马钱子碱NLC，用蒸馏水稀释至适当浓度，滴至覆盖支持膜的铜网上，用滤纸吸去过量液体，放至自然干燥，滴加2%磷钨酸染色约30 s，置于透射电镜下观察，结果见图1。可见，制备的马钱子碱NLC呈完整的类球形实体粒子，粒子之间无明显粘连，且分布较均匀。
2.3 粒径及Zeta电位测定
取马钱子碱NLC适量，用蒸馏水稀释至适宜浓度，轻摇振荡，使其均匀分散，放入样品池中，使用激光粒度分析仪测定样品平均粒径、多分散性指数（PDI）和Zeta电位，各样品平行测定3次。结果显示，马钱子碱NLC的粒径为（137.20±1.11）nm，PDI为0.14±0.05，Zeta电位为（-34.40±0.32）mV，粒径呈正态分布。
2.4 包封率及载药量测定
参考本课题组前期建立的方法[10]测定马钱子碱NLC包封率和载药量，结果显示，平均包封率为（67.96±3.11）%，平均载药量为（1.81±0.04）%。
2.5 差热分析
分别取适量马钱子碱对照品、空白NLC、马钱子碱NLC、马钱子碱和空白NLC的物理混合物，于WTC-1D/2D微机差热天平，设置升温速度为10 ℃/min，从室温升至500 ℃，进行差热分析实时监控扫描，结果见图2。可以看出，马钱子碱对照品的特征熔点峰为178 ℃，马钱子碱和空白NLC的物理混合物出现马钱子碱特征熔点峰，而马钱子碱NLC的马钱子碱特征熔点峰消失，表明马钱子碱以非结晶态存在于马钱子碱NLC内，可能为分子态或不定形状态。
2.6 体外释放介质考察
2.6.1 透析袋前处理
戴手套将透析袋剪为适宜长度的小段，先用大量50%乙醇煮沸1 h，再依次用50%乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和1 mmol/L EDTA（pH=8.0）溶液洗涤，最后用蒸馏水彻底洗净，放入含50%乙醇的蒸馏水中，置4 ℃冰箱内保存备用，保存过程中确保透析袋完全浸没在溶液内，使用前于释放介质中浸泡24 h。
2.6.2 释放介质选择
文献报道马钱子碱在PBS中的溶解度随着乙醇含量的增加而增加[11-12]，故选择分别含10%、20%、40%乙醇、pH 7.4的PBS，以及含0.1%吐温-80、pH 7.4的PBS，进行稳定性和溶解度的考察。结果表明，马钱子碱在40%乙醇、pH 7.4的PBS中溶解度最高，但是考虑到乙醇可使马钱子碱NLC混悬液破乳，若乙醇含量过高则可能影响马钱子碱NLC的稳定性，最终选择含20%乙醇、pH 7.4的PBS作为释放介质，既可达到漏槽条件，又不影响马钱子碱NLC混悬液的穩定性。
2.6.3 释放介质稳定性考察
精密量取5 mg马钱子碱对照品，溶于50 mL含20%乙醇、pH 7.4的PBS，置于具塞溶出瓶中，设置恒温水浴振荡器温度为（37.0±0.2）℃，振摇速度为（100±2）r/min，在0～48 h时间段内抽样测定药物的峰面积，结果峰面积RSD=0.98%（n=9），表明在设定的温度与时间内，药物与释放介质的稳定性均满足测定要求。
2.7 体外释放分析方法的建立
2.7.1 色谱条件
采用Dikma C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇∶水-乙酸-三乙胺（230∶2.4∶0.3）=30∶70，检测波长为265 nm，流速1 mL/min，进样量10 μL，柱温30 ℃。
2.7.2 对照品贮备液制备
精密量取马钱子碱对照品适量，置于10 mL容量瓶中，用释放介质溶解并定容，即得132.00 μg/mL的马钱子碱对照品贮备液。
2.7.3 标准曲线绘制
分别精密吸取马钱子碱对照品贮备液，用释放介质稀释，配制成浓度分别为132.00、66.00、33.00、16.50、8.25、2.45 μg/mL系列马钱子碱对照品溶液，按上述色谱条件进样测定，以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标绘制标准曲线，求得线性回归方程：Y=37 195X-2813.7，r2=0.999。结果表明，马钱子碱在2.45～132.00 μg/mL范围内线性关系良好。
2.7.4 回收率试验
在空白释放介质中分别加入马钱子碱对照品各3份，使其浓度分别为66.00、16.50、8.25 μg/mL，进样测定，计算回收率。结果低、中、高浓度马钱子碱平均回收率分别为98.22%、99.00%、98.50%，RSD分别为1.25%、1.45%、1.28%，符合含量测定要求[12]。
2.7.5 精密度试验
精密吸取馬钱子碱对照品贮备液10 ?L，于同一日内连续进样6次，连续进样6 d，测定峰面积，计算日内精密度及日间精密度。结果日内精密度RSD=1.30%，日间精密度RSD=1.73%，表明日内精密度及日间精密度均良好，符合含量测定要求[12]。
2.7.6 稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液10 ?L，分别于0、2、4、8、10、12 h进样，记录峰面积，结果RSD=0.50%，表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.7.7 重复性试验
取同一批供试品6份，按“2.7.2”项下方法制成供试品溶液，进样，记录峰面积，结果RSD=0.90%，表明本方法重复性良好[13]。
2.8 体外释药行为研究
2.8.1 体外释药曲线绘制
采用动态膜透析法进行马钱子碱NLC体外释放研究。精密称取马钱子碱NLC冻干品（相当于马钱子碱5 mg），用5 mL生理盐水稀释，确保使马钱子碱NLC处于均匀混合状态，转入处理过的透析袋中，扎紧透析袋两端，放入具塞锥形瓶中，精密量取50 mL释放介质（含20%乙醇、pH 7.4的PBS），放入具塞锥形瓶中，调整透析袋位置，使透析袋完全浸没在释放介质中，放入恒温水浴震荡器中（温度37.0 ℃±0.2 ℃，振摇速度100 r/min）。释放开始后，分别于0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、6、8、10、12、18、24、36、48、60、72、84 h，用移液枪量取1 mL透析含药外液，同时补充相同体积的透析空白外液，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，按“2.7.1”项下色谱条件进样测定，平行测定3次，计算马钱子碱NLC的药物累积释放率。各时间点的药物累积释放率（Q）计算公式为：
式中，V0为释放介质的总体积（mL），Ct为各时间点测得的药物浓度（?g/mL），V为每次取样体积，W为投入药物总质量（mg）。
另精密称取相同质量的马钱子碱原料药，按上述方法操作，进行体外释药研究。以累积释放率对释药时间作图，马钱子碱原料药与马钱子碱NLC的药物累积释放曲线见图3。
结果表明，在含20%乙醇pH 7.4的PBS释放介质中，马钱子碱原料药释药相对较快，12 h马钱子碱已基本全部释放，累积释放率为94.66%，而马钱子碱NLC前4 h释药较快，累积释放率为30.86%，之后释药曲线渐趋平稳，药物缓慢释放，48 h药物基本释放完全，72 h累积释放率为86.74%。可见，将马钱子碱制成NLC具有一定的缓释效果。
2.8.2 体外释药动力学拟合
采用零级动力学方程、一级动力学方程、Higuchi模型对马钱子碱NLC的释药曲线进行拟合[14]，回归方程见表1。R2越接近1，表明方程的拟合效果越好。结果显示，马钱子碱NLC体外释放拟合最好的是Higuchi方程（R2=0.965 9），属于典型的缓释模型，表明马钱子碱NLC具有一定的缓释作用。
3 讨论
NLC进入体内后，其行为表现及药效作用的发挥很大程度上取决于自身的制剂学性质，因此，制剂学性质考察是对NLC进行安全性、有效性、稳定性评估的基础。本课题制备的马钱子碱NLC呈完整的类球形实体粒子，粒子之间无明显粘连，粒径较小，Zeta电位测定结果显示粒子表面带负电，存在电子斥力，粒子间不会发生聚集，其绝对值较高，体系较稳定，可用于后续研究。
目前对纳米粒释药机制的评价较单一，大多数情况采用模拟人体内部环境进行体外释药试验研究，并据此推测药物的体内释放行为。鉴于马钱子碱在PBS中的溶解度随着乙醇含量增加而增加的特点，本研究释放介质选择含10%、20%、40%乙醇pH 7.4的PBS，及含0.1%吐温-80、pH 7.4的PBS对马钱子碱的稳定性进行考察，综合考虑试验结果，最终选择20%乙醇pH 7.4的PBS作为马钱子碱NLC的释放介质。体外释放试验结果表明，将马钱子碱NLC具有缓释特性，其释放规律符合Higuchi方程。马钱子碱NLC前期有突释现象，推断为部分药物聚集在外层;后期药物释放缓慢，可能为被包埋的药物通过纳米粒微孔扩散变得困难，药物释放主要取决于脂质的溶蚀。马钱子碱NLC在体内以先快后慢的方式释放药物，先释放的药物可迅速起效，缓慢释放的药物可以持续作用，从而取得更好的治疗效果。将马钱子碱制备成纳米制剂后通过静脉注射给药，可以避免口服给药带来的自身诱导代谢作用，提高靶向性。
药物从NLC内释放的实际过程很复杂，与诸多因素有关，除药物在纳米粒中所处的位置因素外，还涉及载体材料、表面电荷、粒子密度、药物与粒子间的物理化学作用，以及释药环境等诸多因素[15-18]。尽管NLC体外释药情况与体内存在差别，但仍可在一定程度上反映体内释药情况，为预测马钱子碱NLC体内释药情况提供依据，指导其处方设计和制备工艺的改进。
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（收稿日期：2018-09-20）
（修回日期：2018-10-16;编辑：陈静）
