王茜 王亚芬 张一昕 石铖 郭秋红 韩雪 郝蕾
摘要：目的 觀察解毒护肝方对药物性肝损伤大鼠TLR3/TNF-α/JNK2信号通路的影响。方法 采用对乙酰氨基酚灌胃制作大鼠肝损伤模型。将实验大鼠按体质量随机分为正常组、模型组、阳性对照组和解毒护肝方高、中、低剂量组，各给药组给予相应药液灌胃，正常组和模型组给予生理盐水灌胃。生化分析仪检测血清AST、ALT活性和总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）含量;RT-PCR和Western blot分别检测肝组织JNK2基因和蛋白的表达;酶标仪检测肝组织匀浆肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）含量;免疫组化染色观察Toll样受体3（TLR3）蛋白表达。结果 与正常组比较，模型组大鼠ALT、AST、DBIL、TNF-α水平显著升高（P<0.01），JNK2 mRNA和p-JNK2、TLR3蛋白表达显著升高（P<0.01）;与模型组比较，解毒护肝方中、低剂量组大鼠AST、ALT活性显著降低（P<0.05，P<0.01），解毒护肝方低剂量组大鼠DBIL含量显著降低（P<0.05），解毒护肝方高剂量组大鼠TNF-α含量显著降低（P<0.01），解毒护肝方高、中剂量组大鼠JNK mRNA和TLR3蛋白表达均显著下调（P<0.05，P<0.01），p-JNK2蛋白表达有降低趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。结论 解毒护肝方对药物性肝损伤大鼠有明显的保护作用，以中、低剂量组效果最为明显，其机制可能与调控TLR3/TNF-α/JNK2信号通路有关。
关键词：解毒护肝方;对乙酰氨基酚;药物性肝损伤;JNK2;大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2019）08-0060-06
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.08.013 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Abstract： Objective To observe the effects of Jiedu Hugan Prescription on TLR3/TNF-α/JNK2 signaling pathway of acetaminophen-induced hepatotoxicity rats. Methods Hepatotoxicity rat model was prepared by intragastric administration of acetaminophen. The rats were randomly divided into normal group， model group， positive control group， Jiedu Hugan Prescription high-， medium- and low-dosage groups. Each administration group was given relevant medicine infusions for gavage， normal group and model group were given normal saline for gavage. At the end of the experiment， the levels of AST， ALT， TBIL and DBIL were detected by biomedical analyzer. JNK2 gene and protein expression in liver tissue were detected by RT-PCR and Western blot. The contents of TNF-α and IL-6 in liver tissue homogenate were detected by enzyme microplate reader. The expression of Toll-like receptor 3 （TLR3） protein was observed by immunohistochemistry. Results Compared with the normal group， the levels of ALT， AST， DBIL and TNF-α in the model group significantly increased （P<0.01）， and the expressions of JNK2 mRNA， p-JNK2， and TLR3 protein significantly increased （P<0.01）. Compared with the model group， the activities of AST and ALT in Jiedu Hugan Prescription medium- and low-dosage groups significantly decreased （P<0.05， P<0.01）; the content of DBIL level in Jiedu Hugan Prescription low-dosage group significantly decreased （P<0.05）; the content of TNF-α in Jiedu Hugan Prescription high-dosage group significantly decreased （P<0.01）. The expressions of JNK mRNA and TLR3 protein in Jiedu Hugan Prescription high- and medium-dosage groups were significantly down-regulated （P<0.05， P<0.01）， and the expression of p-JNK2 protein decreased， without statistical significance （P>0.05）. Conclusion Jiedu Hugan Prescription has obvious protective effects on rats with drug-induced hepatotoxicity， and the effects are most obvious in the medium- and low-dosage groups. The mechanism may be related to the regulation of TLR3/TNF-α/JNK2 signaling pathway.
Keywords： Jiedu Hugan Prescription; acetaminophen; drug-induced hepatotoxicity; JNK2; rats
临床上，对乙酰氨基酚（APAP）是应用广泛的解热镇痛药，但其大剂量服用或联合使用则会诱发药物性肝损伤，严重者可导致肝衰竭甚至死亡。据美国食品药品监督管理局统计，过量服用含APAP的药品是导致患者肝衰竭最主要的因素[1]。JNK2為c-Jun氨基末端激酶（JNK）的亚型之一，几乎在所有的细胞中均有表达。研究表明，JNK2基因敲除对肿瘤坏死因子（TNF）介导的肝细胞损伤具有保护作用，从而推测JNK2在APAP诱导的肝损伤中发挥重要作用[2-4]。中医学根据药物性肝损伤的临床特点，将其归属于“黄疸”“积聚”等范畴，而肝失疏泄、气滞血瘀、脾失健运、湿浊内生为其主要的发病机制，疏肝健脾、活血祛瘀、解毒除湿为其有效治法。基于上述认识，本课题组自拟解毒护肝方，该方由逍遥丸、茵陈蒿汤、小柴胡汤三方加减化裁而成，具有疏肝健脾、除湿解毒、活血祛瘀功效，临床用于防治药物性肝损伤具有一定的疗效。为进一步探讨其作用机制，本实验采用APAP灌胃制作大鼠肝损伤模型，观察解毒护肝方对模型大鼠TLR3/TNF-α/JNK2信号通路的影响。
1 材料与方法
1.1 动物
清洁级Wistar大鼠70只，雌雄各半，体质量180～220 g，北京维通利华生物技术有限公司提供，动物质量合格证号11400700181914，动物生产许可证号SCXK（京）2012-0001。饲养于河北省中药配方颗粒工程技术研究中心动物室（万级洁净屏障系统），温度（23±2）℃，相对湿度60%～70%，12 h明暗交替，自由摄食饮水。
1.2 药物
解毒护肝方（柴胡10 g，醋香附15 g，白术10 g，炒白芍15 g，五味子10 g，黄芪15 g，茵陈15 g，黄芩10 g，丹参15 g，楮实子10 g，田基黄15 g，甘草10 g），饮片均为免煎颗粒，四川新绿色药业科技发展有限公司。水飞蓟宾胶囊（每粒含水飞蓟宾35 mg，批号750709172），天津天士力圣特制药有限公司;对乙酰氨基酚片（每片含APAP 0.5 g，批号016171002），石药集团欧意药业有限公司。
1.3 主要试剂与仪器
AST测定试剂盒（批号AUZ3645）、ALT测定试剂盒（批号AUZ3689），贝克曼库尔特实验系统有限公司;总胆红素（TBIL）试剂盒（批号A005）、直接胆红素（DBIL）试剂盒（批号A006），长春汇力生物技术有限公司;TNF-α（批号T15030357）、白细胞介素-6（IL-6，批号S01030358），武汉华美生物工程有限公司;Trizol（批号139603），Invitrogen公司;TIANscript cDNA第一链合成试剂盒（批号P5011）、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green，批号Q5922），天根生化科技（北京）有限公司;JNK2兔多抗、p-JNK2（Tyr185）兔单抗，Cell Signaling Technology公司;β-actin小鼠单抗、辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L）、Peroxidase-Conjugated Goat anti-Rabbit IgG（H+L）、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L）、Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG（H+L）、TLR3兔多抗（批号00009333）、二抗（Goat，批号K186817A），DAB（批号K186916P），北京中杉金桥生物技术有限公司。Humalyzer2000半自动生化仪（德国豪迈），DP73数码显微镜（日本Olympus），HMIAS-2000显微图像分析系统（武汉同济医科大学），酶标仪（BioTek，ELx800），荧光定量PCR仪ABI7500（Applied Biosystems），电泳仪（北京百晶生物技术有限公司），生物分光光度计（Eppendorf），电泳槽（美国BioRad），转移脱色摇床（海门其林贝尔仪器制造公司），Tanon Gis电泳图像分析系统（Tanon1600），Quantity one分析软件（Bio Rad Technical Service Department）。
1.4 造模、分组和给药
大鼠每日灌胃APAP 1200 mg/kg药液（40 ℃生理盐水配制）1次，连续30 d，制作大鼠肝损伤模型[5-6]。将成模大鼠按体质量随机分为模型组、阳性对照组和解毒护肝方高、中、低剂量组，每组12只，另取10只大鼠为正常组，雌雄各半。解毒护肝方高、中、低剂量组分别给予63、31.5、15.75 g原药材/kg药液灌胃，阳性对照组给予水飞蓟宾（44 mg/kg）药液灌胃，正常组和模型组给予等体积生理盐水灌胃。给药体积均为1 mL/100 g，每日1次，连续30 d。实验期间每7 d称重1次，自由摄食饮水。
1.5 标本制备
实验结束后，大鼠3.5%水合氯醛（1 mL/100 g）腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，全血分别置于清洁试管中，4000 r/min离心10 min，分离血清，分装置于-80 ℃冰箱保存，待检相关肝功能指标。取血后迅速取固定部位肝组织3份，1份置于4%多聚甲醛液中固定，用于肝组织病理形态观察，另2份置于冻存管，液氮冻存，-80 ℃冰箱保存，用于JNK2基因和蛋白的表达、肝匀浆上清液TNF-α和IL-6含量的测定。
1.6 指标检测
1.6.1 一般观察
给药后观察大鼠精神状态、行为活动、饮食情况、二便情况和皮肤毛色。
1.6.2 生化指标检测
应用半自动生化分析仪检测血清AST、ALT、TBIL、DBIL含量;应用酶标仪检测肝匀浆TNF-α和IL-6的含量。上述操作均按试剂盒说明书进行。
1.6.3 病理形态观察
取4%多聚甲醛溶液固定肝组织，常规脱水、包埋、切片、HE染色，镜下观察。
1.6.4 RT-PCR检测肝组织JNK2基因的表达
用Trizol提取组织样本中总RNA。取5 μL RNA，1%琼脂糖凝胶电泳，以检测RNA的完整性。引物序列由Primer5.0软件设计。β-actin上游引物5'-CCT CCTGAACTTGAGGCAGTTTA-3'，下游引物5'-CTCT GGGGCTGTCAGTCTTG-3';JNK2上游引物5'-GACA GTAAAAGCGATGGC-3'，下游引物5'-TTGGTTCTG AAAAGGACG-3'。扩增片段均为638 bp。用TIANscript RT KIT进行反转录，实验操作按产品说明书进行。用荧光定量PCR仪，采用2-ΔΔCt法进行数据相对定量分析，ΔΔCt=（待测组目的基因平均Ct值-待测组内参基因平均Ct值）÷（对照组目的基因平均Ct值-对照组内参基因平均Ct值）。
1.6.5 Western blot检测肝组织JNK2蛋白的表达
取约100 mg组织加液氮研磨成粉末，加入1 mL裂解液（裂解液中含有临时加入的10 μL蛋白酶抑制剂混合物），研磨，直至成为液体，转至EP管，冰上静置10 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min。根据蛋白定量结果，加入相应体积总蛋白样品与5×蛋白质凝胶电泳上样缓冲液，混合，95 ℃变性10 min，将样品加至凝胶孔中，进行凝胶电泳。凝胶电泳结束后，将凝胶上分离到的蛋白条带转印至PVDF膜，然后分别用非标记一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗对其进行孵育、检测。取上清液，加入等体积2×SDS上样缓冲液，100 ℃中煮沸5 min。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，每孔上样等量总蛋白。利用水浴式电印迹法将蛋白转移至膜上。室温振荡封闭膜1 h，将一抗用封闭液稀释1000倍;将封闭后的膜直接放入一抗工作液中，4 ℃反应过夜，将反应膜放入平皿中，用1×TBST洗涤3次，每次10 min，洗净未结合的一抗。将二抗用1×TBST稀释3000倍;将洗涤后的一抗反应膜放入二抗工作液中（室温、避光缓慢摇动）作用60 min。用1×TBST洗涤3次，每次10 min，洗去游離二抗。按1∶1（V/V）混合ECL试剂盒中2种液体，再将混合液均匀铺在PVDF膜表面，室温作用4 min。抖掉膜上液体，将其放入铺有保鲜膜的曝光盒，曝光并洗片，最后采用Tanon1600对胶片进行扫描，用Tanon Gis软件分析，系统自动生成灰度值。
1.6.6 免疫组化检测肝组织Toll样受体3蛋白的表达
采用免疫组化方法观察，每组取6只大鼠，每例测5个视野。由计算机算出所测阳性反应物相对含量的积分光密度（IOD）和平均光密度（MOD）。
1.7 统计学方法
采用SPSS13.5统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，采用方差分析，方差齐用LSD法检验，方差不齐用DunnettT3检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般状况
正常组大鼠毛发滑顺、有光泽，精神状态良好，行动灵活，二便正常;模型组大鼠体质量减轻，毛发无光泽，精神状态欠佳，喜卧;各给药组大鼠毛发光泽度、精神状态、体质量及行动灵活性均有改善。
2.2 解毒护肝方对模型大鼠血清肝功能指标的影响
与正常组比较，模型组大鼠ALT、AST、DBIL水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，阳性对照组和解毒护肝方中、低剂量组大鼠ALT、AST活性显著降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），解毒护肝方低剂量组大鼠DBIL含量显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）;与解毒护肝方高剂量组比较，解毒护肝方中剂量组大鼠ALT、AST活性显著降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见表1。
2.3 解毒护肝方对模型大鼠肝组织病理形态的影响
正常组大鼠肝细胞排列整齐，围绕中央静脉放射状排列，细胞核形态正常，胞浆均匀，无变性及坏死;模型组大鼠肝细胞排列紊乱，细胞呈现广泛水肿变性，散在少量点状坏死;解毒护肝方高、中、低剂量组较模型组大鼠细胞结构紊乱有不同程度的改善，局部细胞水肿变性，未观察到点状坏死，以中、低剂量组改善尤为明显。结果见图1。
2.4 解毒护肝方对模型大鼠肝组织肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6含量的影响
与正常组比较，模型组大鼠肝组织TNF-α含量显著升高（P<0.01）;与模型组比较，阳性对照组和解毒护肝方高剂量组大鼠肝组织TNF-α含量显著降低（P<0.05，P<0.01）;各给药组大鼠肝组织IL-6含量差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表2。
2.5 解毒护肝方对模型大鼠肝组织JNK2基因和蛋白表达的影响
与正常组比较，模型组大鼠肝组织JNK2 mRNA和p-JNK2蛋白表达显著升高（P<0.01）;与模型组比较，解毒护肝方各剂量组大鼠肝组织JNK2 mRNA表达显著降低（P<0.01），p-JNK2蛋白表达有降低趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）;与阳性对照组比较，解毒护肝方中、低剂量组大鼠肝组织JNK2 mRNA和p-JNK2蛋白表达显著降低（P<0.05，P<0.01）。结果见表3、图2。
2.6 解毒护肝方对模型大鼠肝组织Toll样受体3蛋白表达的影响
与正常组比较，模型组大鼠肝组织TLR3蛋白IOD、MOD值均显著升高（P<0.01）;与模型组比较，阳性对照组和解毒护肝方高、中剂量组大鼠肝组织TLR3蛋白IOD、MOD值均显著降低（P<0.01）;与解毒护肝方低剂量组比较，阳性对照组和解毒护肝方高、中剂量组大鼠肝组织TLR3蛋白IOD、MOD值均显著降低（P<0.05，P<0.01）。结果见表4、图3。
3 讨论
临床上常用ALT和AST作为反映肝细胞损伤程度的生化指标。正常情况下，二者在血清中含量很低，但当肝细胞受到损伤时，细胞发生变性及坏死，细胞膜通透性增加或发生崩解，ALT、AST释放入血，血中ALT、AST活性升高。
DBIL能溶于水，可通过肾脏随尿液排出体外。在发生广泛的肝损伤或直接抑制胆汁转运蛋白时会使TBIL含量升高。当发生红细胞破坏过多或肝细胞对胆红素出现转运、结合、排泄缺陷以及胆管阻塞时，亦可导致胆红素代谢障碍。实验结果显示，模型组大鼠肝组织ALT、AST、DBIL水平显著升高，提示肝损伤模型建立成功;与模型组比较，阳性对照组和解毒护肝方中、低剂量组均能显著降低大鼠肝组织ALT、AST活性，解毒护肝方低剂量组又能显著降低大鼠肝组织DBIL含量;各给药组均能不同程度降低大鼠肝组织TBIL含量，但各组间差异无统计学意义（P>0.05）。提示各给药组对损伤的肝细胞均有不同程度的改善作用，尤以解毒护肝方中、低剂量组效果为佳。
有研究显示，炎症因子参与了APAP所致肝损伤的发生、发展过程。主要由APAP代谢产物N-乙酰-对-苯醌亚胺与肝脏中蛋白酶结合形成毒性物质，刺激肝Kupffer细胞产生并释放TNF-α、IL-6等炎症因子，其中TNF-α主要参与调控炎症发生和细胞凋亡，被认为是炎症反应过程中出现最早的炎症介质[7-8]。而JNK2在TNF-α诱导的细胞凋亡中及APAP所致的肝损伤中发挥重要作用[9]。有研究显示，JNK2基因缺失的肝细胞比野生细胞或JNK1基因缺失肝细胞更耐TNF-α诱导的细胞凋亡，且对APAP引起的肝损伤表现出部分的保护作用[10-12]。也有研究发现，TLR3基因敲除小鼠也能免疫APAP所致的肝损伤，TLR3能增强TNF-α的表达及磷酸化JNK在APAP伤肝脏中的表达[13]。本实验结果显示，各组大鼠肝组织IL-6水平差异无统计学意义（P>0.05），模型组大鼠肝组织TNF-α含量、JNK2基因和蛋白表达及TLR3的表达显著升高，解毒护肝方各剂量组均能不同程度的降低肝组织TNF-α含量，下调肝组织JNK2基因和蛋白表达，减少肝组织TLR3的阳性表达，其中解毒护肝方高剂量组能显著降低肝组织TNF-α含量，解毒护肝方高、中剂量组均能显著降低TLR3的阳性表达，解毒护肝方各剂量组均能显著降低JNK2的基因表达，而对p-JNK2蛋白表达仅有降低趋势，差异未见统计学意义，可能是由于本实验中APAP所致肝损伤对JNK2的影响尚处在转录阶段，从而未产生明显蛋白水平的变化，后续拟增加造模剂量和延长给药时间继续探讨其对JNK2蛋白水平的影响。
综上，本研究结果表明，解毒护肝方各剂量组均有一定的护肝作用，其机制主要通过抑制TLR3的表达，从而抑制促炎因子TNF-α的产生，下调JNK2基因的表达来实现护肝作用。但实验结果显示，解毒护肝方中、低剂量组能显著降低血清肝功能指标，而解毒护肝方高剂量组对肝组织TNF-α含量、JNK2基因表达有很好的调节作用，解毒护肝方高、中剂量组对TLR3的表达有较好的调节作用，结合肝组织病理形态学变化，解毒护肝方高剂量组肝脏病理变化较中、低剂量组严重。本实验中解毒护肝方低剂量为临床等效剂量，中剂量为等效剂量的2倍，高剂量为等效劑量的4倍，笔者认为，基于临床合理安全用药的原则，虽然高剂量组对早期炎症因子和基因水平均有较好的调节作用，但由于剂量较大也加重了肝脏的负担，故在中、低剂量也有一定疗效的情况下，选择相对较低的剂量治疗疾病更符合临床安全用药的需求。
参考文献：
[1] JAESCHKE H. Acetaminophen：dose-dependent drug hepatotoxicity and acute liver failure in patients[J]. Digestive Diseases，2015， 33（4）：464-471.
[2] CUBERO F J， ZOUBEK M E， HU W， et al. Combined activities of JNK1 and JNK2 in hepatocytes protect against toxic liver injury[J]. Gastroenterology，2016，150（4）：968-981.
[3] SEKI E， BRENNER D A， KARIN M， et al. C57BL/6 substrains of genetically engineered mice and wild-type controls can lead to confounding results as it did in studies of JNK2 in acetaminophen and concanavalin a liver injury[J]. Chem Res Toxicol，2011，24（6）：794-796.
[4] MOHAMMED B， MIDHUN C， CHAKRABORTY M， et al. Protective role of c-Jun N-terminal kinase 2 in acetaminophen induced liver injury[J]. Biochem Biophys Res Commun，2008，374（1）：6-10.
[5] 張蕾，詹俊，伍百贺，等.TNF-α在对乙酰氨基酚所致大鼠药物性肝损伤中的作用[J].胃肠病学和肝病学杂志，2014，23（10）：1181-1183.
[6] 王雁，汤纳平，富欣，等.对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤大鼠血浆miR-122表达的变化[J].中国药理学与毒理学杂志，2013，27（5）：854- 859.
[7] 张蕾，詹俊，伍百贺，等.TNF-α在对乙酰氨基酚所致大鼠药物性肝损伤中的作用[J].胃肠病学和肝病学杂志，2014，23（10）：1181-1183.
[8] KNOCKAERT L， DESCATOIRE V， VADROT N， et al. Mitochondrial CYP2E1 is sufficient to mediate oxidative stress and cytotoxicity induced by ethanol and acetaminophen[J]. Toxicol in Vitro， 2011，25（2）：475-484.
[9] JAVELAUD D， BESANCON F. NF-κB activation results in rapid inactivation of JNK in TNF-α-treated Ewing sarcoma cells： a mechanism for the anti-apoptotic effect of NF-κB[J]. Oncogene， 2001，20（32）：4365-4372.
[10] WAGNER E F， NEBREDA A R. Signal integration by JNK and p38 MAPK pathways in cancer development[J]. Nat Rev Cancer，2009，9（8）：537-549.
[11] KODAMA Y， TAURA K， MIURA K， et al. Antiapoptotic effect of c-Jun N-terminal Kinase-1 through Mcl-1 stabilization in TNF-induced hepatocyte apoptosis[J]. Gastroenterology，2009，136（4）：1423-1434.
[12] GUNAWAN B K， LIU Z X， HAN D， et al. c-Jun n-terminal kinase plays a major role in murine acetaminophen hepatotoxicity[J]. Gastroenterology，2006，131（1）：165-178.
[13] CAVASSANI K A， MOREIRA A P， HABIEL D， et al. Toll like receptor 3 plays a critical role in the progression and severity of acetaminophen-induced hepatotoxicity[J]. PLoS One，2013，8（6）：e65899.
（收稿日期：2019-01-18）
（修回日期：2019-03-21;编辑：华强）
