阿布力米提·阿布来提
【中图分类号】R734.2 【文献标识码】B 【文章编号】2095-6851（2017）10-00-01
相关研究结果[1]显示肺泡上皮细胞向间质细胞转化（EMT）是A549细胞上皮间叶转型的重要机制之一，在众多的参与EMT的细胞因子中，转化生长因子发挥着重要的作用，现已有文献研究结果[2]显示了蜂毒肽对肺癌（A549细胞）EMT（上皮间叶转型）过程有一定的影响，可能成为未来治疗的研究方向。为了进一步探讨蜂毒肽对肺癌（A549细胞）EMT（上皮间叶转型）过程的影响，笔者总结相关研究资料，现将结果报道如下：
1 材料与方法
1.1 試验材料 （试剂里加入N-cad，E-cad，Vimentin的有关信息）主要实验材料包括：蜂毒肽（来源于浙江中医药大学药学院）；肺腺癌细胞株A549（购自中国医学科学院基础研究所细胞库）；Ham'F12培养基、高糖DMEM培养基（美国Life Technologies 公司），BCA试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；Trizol Reagent（美国Invitrogen生命技术有限公司）。
1.2 实验方法 先进行细胞分组，在进行细胞培养，分组方法为档细胞当细胞生长融合至70%～80%，用无血清培养基饥饿24h，使细胞静止于同步期，随机将细胞分为空白对照组和蜂毒肽组，分别作用24小时、48小时和72小时。分别在24、48、72h时间点收集各组细胞，按试剂盒说明书提取细胞总蛋白：弃培养液，加入细胞蛋白裂解液，BCA试剂盒蛋白定量。各组标本加入蛋白上样缓冲液行SDS-PAGE电泳，电转移至PVDF膜上，脱脂奶粉室温封闭1h，兔抗人一抗4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（二抗）室温2h，ECL发光显色，采用凝胶成像系统成像，利用图像分析软件进行分析，以GAPDH为内参，计算目的蛋白与内参灰度的相对比值。Vimentin测定方法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝基纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
1.3 统计指标 空白对照组和蜂毒肽组在72h时间点时统计72小时时间点的E-cad，N-cad，Vimentin蛋白表达统计结果，并以组别为单位计算平均值。
1.4 统计学方法 选择spss21.0统计学软件包进行数据分析，对E-cad蛋白表达统计数据的分析方法选择t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义的标准。
2 结果
蜂毒肽组在72h时间点时的E-cad蛋白表达均值为（5.65±0.09），明显高于空白对照组E-cad蛋白表达水平；蜂毒肽组在72h时间点时的N-cad蛋白表达均值为（2.68±0.16）、72小时的Vimentin蛋白表达均值为（1.67±0.22），均明显低于空白对照组相应数据结果（P<0.05），具体数据统计结果如下表1：
3 讨论
由本研究数据统计结果可以看出：蜂毒肽能在蛋白和基因水平增加E-cad的表达，且呈浓度依赖性和时间依赖性，说明洋金花总碱能在一定程度上抑制A549细胞的EMT过程，从而延缓A549细胞上皮间叶转型进程，具有明显的临床作用特点。A549细胞上皮间叶转型发病多从肺泡炎开始，作为病变开始的靶细胞除了血管内皮细胞外，还有相当数量的肺泡细胞，特别是Ⅱ型肺泡上皮细胞。A549细胞与来源于人的原代Ⅱ型肺泡细胞，在病毒诱发的损伤中TGF-β1mRNA的表达水平、凋亡相关因子Caspse3/7的活性及细胞增殖能力均接近，诱导它增殖和EMT可以模拟Ⅱ型肺泡上皮细胞在病理状态下参与体内A549细胞上皮间叶转型形成过程。蜂毒肽能够杀伤肿瘤细胞并阻止肿瘤细胞的生长，对正常细胞的生长无明显的影响。蜂毒素能够插入K562细胞的细胞膜中，形成孔道，促进Ca2+内流，使细胞内的Ca2+浓度升高，造成细胞裂解，起到直接杀伤K562细胞的作用。普遍认为蜂毒素使细胞线粒体膜溶解，导致肿瘤细胞正常呼吸功能受到抑制，破坏其有氧呼吸的能力，使得肿瘤组织生长受到抑制，起到直接杀伤肿瘤细胞的作用。
维持细胞结构和形态的细胞骨架由一系列复杂的结构蛋白组成，包括微管（micro tubules）、微丝（micro filaments）和中问丝（intermediate filament，IF）。波形蛋白（vimentin）属于III型IF，表达在间充质细胞和一些外胚层细胞，如成纤维细胞和内皮细胞高丰度表达，常在分化特异性的中间丝蛋白，如肌间线蛋白（desmin）和神经丝蛋白（neuro filament proteins）表达和整合前形成支撑网络[5]。IF是细胞骨架结构组成中微丝和微管之外的另一类主要的结构成分，从核到膜呈放射状分布，在维持和调节细胞功能中起重要作用，如细胞收缩、迁移、增殖、蛋白合成、基因表达、细胞凋亡和机械力传导。目前对于中间丝蛋白vimentin在人类恶性肿瘤中的研究也显示出vimentin参与肿瘤转移复杂的过程，在肿瘤细胞和内皮细胞的迁移、粘附和上皮癌的上皮问质化（epithelial—mesenchymal transition，EMT）及肿瘤细胞凋亡中均起一定的作用。虽然早期研究认为vimentin的功能不十分重要，因为一些实验研究发现vimentin的破损不会影响细胞形状。应用vimentin抗体后，也不影响细胞的运动和有丝分裂能力，而且vimentin缺陷细胞的生长增殖能力不受影响，在整体动物和组织水平，vimentin缺陷小鼠未显示明显的发育、繁殖、结构和生理学特性差异。然而，最近的研究显示[6]，vimentin在细胞的许多重要功能中必不可少。近几年研究显示，vimentin在肿瘤发生、发展中参与细胞的粘附、迁移和细胞凋亡等过程，在肿瘤转移过程中起重要作用。研究显示，虽然细胞形状没有明显改变，但细胞粘着斑的空间结构发生了改变，因此不能仅从细胞形状来反映vimentin的功能；vimentin缺陷细胞由于DNA合成减少，增殖速度明显减慢引。抑制70%的vimentin表达将有效地削弱肿瘤的侵袭和迁移能力J。阐明其在肿瘤侵袭、迁移和转移过程中细胞骨架分子间的作用（如plectin这个细胞骨架连接蛋白连接vimentin与其他细胞骨架及通过其N末端的剪接变异体连接vimentin与粘着斑）和分子调节机制，将有助于阐明肿瘤转移的复杂过程并将其有望作为抗肿瘤转移治疗的新靶点。endprint
參考文献
Wiedman，G.，Herman，K.，Searson，P. et al.The electrical response of bilayers to the bee venom toxin melittin：Evidence for transient bilayer permeabilization[J].Biochimica et biophysica acta. Biomembranes，2013，1828（5）：1357-1364.
Jason S. Buhrman，Jamie E. Rayahin，Laura C. Cook et al.Active， Soluble Recombinant Melittin Purified by Extracting Insoluble Lysate of Escherichia coli Without Denaturation[J].Biotechnology Progress，2013，29（5）：1150-1157.
Sugihara， K.，Delai， M.，Szendro， I. et al.Simultaneous OWLS and EIS monitoring of supported lipid bilayers with the pore forming peptide melittin[J].Sensors and Actuators， B. Chemical，2012，161（1）：600-606.
Stromstedt AA，Wessman P，Ringstad L et al.Effect of lipid headgroup composition on the interaction between melittin and lipid bilayers[J].Journal of Colloid and Interface Science，2007，311（1）：59-69.
Majumder， A，Kirabo， A，Karrupiah， K et al.Cell Death Induced by the Jak2 Inhibitor， G6， Correlates with Cleavage of Vimentin Filaments[J].Biochemistry，2011，50（36）：7774-7786.
Icenogle，L.M.，Hengel，S.M.，Coye，L.H. et al.Molecular and biological characterization of streptococcal SpyA-mediated ADP-ribosylation of intermediate filament protein vimentin[J].The Journal of biological chemistry，2012，287（25）：21481-21491.endprint
