饶大勇 樊仲国 朱灏
【摘要】目的 研究micro RNA-210（miRNA-210）在大鼠急性心肌梗死（AMI）中调节微血管新生作用并探讨其相关机制。方法 将大鼠按1：1随机分为：假手术组（Sham组）、心肌梗死+阴性病毒对照组（AMI+NV）、心肌梗死组（AMI+PBS）、心肌梗死+miRNA-210激动剂体内转染组（AMI+miRNA-210 agonist）。术后4周以微血管密度（MVD）为效应终点，检测各组内miRNA-210、肝细胞生长因子（HGF）、血管内皮生长因子（VEGF）的mRNA；检测HGF及肌球蛋白重链（β-MHC）的表达，小干扰RNA（siRNA）处理HGF，以WB检测效应终点。结果 AMI+miRNA-210 agonist组HGF表达水平、微血管密度（MVD）随miRNA-210表达增加而显著增加；低氧环境下siRNA显著抑制HUVECs中HGF表达，CD 31表达水平也显著下降；AMI+miRNA-210 agonist组大鼠心脏收缩功能更为优越。结论 心肌内miRNA-210过表达可上调梗死区域内HGF表达水平，促进血管新生，改善心脏收缩功能。
【关键词】微小RNA-210；急性心肌梗死；肝细胞生长因子；血管新生
【中图分类号】R541 【文献标识码】B 【文章编号】ISSN.2095.6681.2018.32..02
急性心肌梗死（AMI）属心血管疾病，致死率高，患者常伴随并发症，这与心肌纤维化、心室重构等相关[1]。因此，促进血管新生，加速心肌细胞功能复苏或可缓解这一过程。Micro RNAs（miRNAs）与AMI的发生有关，对诊断AMI具有一定价值[2]。MiRNA-210为低氧应答因子，可调节内皮细胞（EC）的凋亡、遷移。目前，miRNA-210在AMI中对血管新生的调节作用仍存在争议，因此，本研究通过研究miRNA-210在心肌梗死中的新生血管调节效应，尝试找出其可能的作用基因靶点并探讨相关机制。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验设备及试剂
BIOER荧光定量PCR仪（博日，杭州）、Gel Doc 2000 成像系统（BIO-RAD，美国）、小动物超声仪（维胜，加拿大）；一抗-MHC（#ab 50967）（艾博抗）、一抗-HGF（#BA 0911）（博士德）等。
1.2 动物实验
1.2.1 动物饲养
南京医科大学动物中心提供成年雄性SD大鼠（4周龄，220～240 g），室温：20℃左右，照明：12 h/d，饲养一周后手术操作。
1.2.2 心肌梗死模型建立、分组及慢病毒载体转染
对大鼠行冠脉前降支结扎，建立模型。随机将其分为：假手术组（Sham组）：缝针穿过心肌而不行结扎，心肌梗死+阴性病毒对照组（AMI+NV），心肌梗死组（AMI+PBS），心肌梗死+miRNA-210激动剂体内转染组（AMI+miRNA-210 agonist）。MiRNA-210激动剂和和阴性对照病毒分别加入PBS缓冲液中混匀成0.5 mL混合液，其余组大鼠尾静脉注射PBS缓冲液0.5 mL。
1.2.3 大鼠心功能评估及样本获取
术后4周行超声心动图，包括：左室收缩期及舒张期内径（LVDs，LVDd）、左室收缩期及舒张期容积（LV VOLs，LV VOLd）。计算左室射血分数（LVEF）及左室缩短速率（LVFS）。取心脏组织（剪去血管、右心房、心室组织），心尖部以备即时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）及蛋白印迹实验（WB），其余留作形态学检测等。
1.2.4 qRT-PCR
检测miRNA-210、肝细胞生长因子（HGF）、血管内皮生长因子（VEGF）的表达水平。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为定量内参。Primer 5.0软件设计引物序列。提取总RNA，以（2-ΔΔCt）法定量分析。
1.2.5心脏标本形态学检测及免疫组化分析
对标本进行染色，CD 31抗原结合EC后计算相关指标。计算方法：每个区域选取微血管密集的三处计数并取平均值，平均光密度=累计光密度/区域面积，以两处区域平均光密度的算术平均数为此标本的微血管密度（MVD）。采集图像，以Image-Pro Plus 6.0软件量化分析。
1.3 细胞实验
将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）（美国模式培养物研究所（Manassas，VA，美国））按培养状态分为常氧组（normoxia condition）和低氧组（hypoxic condition）。低氧组HUVECs达50%孵育率后分为两组：接受小干扰RNA（siRNA）转染（siHGF组）、平行对照组（control组），以WB分析。
1.4 WB分析
检测心肌内HGF及β-MHC蛋白表达水平。绘制曲线，上样，转膜，洗膜，封闭。稀释一抗，次日洗膜；稀释二抗，反应1h。Actin为内参。检测HUVECs中HGF、CD 31表达水平，步骤基本同上，GAPDH为内参。
1.5 统计学方法
采用SPSS 22.0统计软件完成数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，正态分布资料采用t检验进行两组间比较，多组间相互比较采用单因素方差分析法，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 大鼠存活情况
术前：48只；术后存活：Sham组12只，AMI+NV组7只，AMI+PBS组8只，AMI+miRNA-210 agonist 组9只。
2.2 心肌内miRNA-210及HGF、β-MHC表达变化情况
AMI+miRNA-210 agonist组miRNA-210表达水平增加最为显著，差异有统计学意义（P<0.001）；该组内HGF表达随之亦显著增加；各组VEGF的表达水平无显著差异，见图1。AMI+miRNA-210 agonist组HGF的表达随miRNA-210表达的增加而增加，AMI+NV组β-MHC表达水平增加最为显著，见图2。
Ⅰ：sham组；Ⅱ：AMI+NV组；Ⅲ：AMI+PBS组；Ⅳ：AMI+miRNA-210 agonist组。说明：*：P<0.05 vs.Ⅰ；#：P<0.05 vs.Ⅱ；&：P<0.05 vs.Ⅲ。
2.3 心肌内HGF过表达对HUVECs的影响
siRNA显著抑制HGF蛋白表达，见图3。CD 31表达水平在低氧环境中随HGF的增加而显著升高；siRNA处理后，EC的分化及增殖速度受到明显抑制，CD 31表达隨之显著下降，见图4。
2.4 心肌内miRNA-210过表达所致心肌组织病理生理及心功能改变
2.4.1 心肌组织内微血管密度计数
与对照组相比，AMI+NV组平均光密度显著衰减（P=0.045）；差异有统计学意义（P<0.05）。AMI+miRNA-210 agonist组较AMI+NV组显著增强（P=0.029），差异有统计学意义（P<0.05）。见图5。
Ⅰ：sham组；Ⅱ：AMI+NV组；Ⅲ：AMI+PBS组；Ⅳ：AMI+miRNA-210 agonist组。说明：*：P<0.05 vs.Ⅰ；#：P<0.05 vs.Ⅱ。
2.4.2 梗死心肌病理改变
三组大鼠心肌纤维均被破坏，AMI+NV组破坏程度甚于AMI+PBS组；AMI+miRNA-210 agonist组破坏程度最小，但仍可见大量炎症细胞浸润及结缔组织增生，见图6。
2.4.3 超声心动图评估大鼠心功能
AMI+NV组LVDs、LV VOLs增大最为显著，LVEF、LVFS随之显著降低；AMI+miRNA-210 agonist组LVEF、LVFS升高最为显著，见表1。
3 讨 论
AMI患者由于心肌细胞缺血、缺氧，心脏收缩力减弱，其预后不佳。有研究表明[3]，miRNA相关家系过表达对心肌细胞有多种作用。另外，多种miRNAs已被为诊断AMI的潜在标志物[4]。本实验发现心肌内miRNA-210过表达可刺激HGF过表达，促进血管EC分化、增殖，从而改善心脏收缩功能。
HGF可调节EC的迁移、增殖，可能与增强细胞内某些涉及细胞骨架重塑、细胞迁移等的信号分子相关[5]。本实验发现miRNA-210诱导心肌梗死后血管新生是通过上调HGF表达实现，而非作用于VEGF靶基因。事实上，维持EC及血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖、迁移之间的平衡是血管新生的重要条件。碱性成纤维细胞生长因子可激活NFκB信号通路促进诸多炎症因子产生，从而诱导增加VSMCs数量。AMI常合并炎症反应，可打破EC、VSMC之间的平衡，而HGF可抑制有关炎性因子的释放，因此miRNA-210过表达后上调HGF表达，可促进EC增殖、迁移，增加梗死区域内微血管新生。
此外，本研究发现miRNA-210过表达可通过改善LVEF、LVFS水平，抑制β-MHC增长，从而增强心肌收缩力，改善心功能。继发于AMI的心室重构早期可引起短期的心脏收缩能力代偿性增加，且梗死区域内的β-MHC蛋白表达量也显著增加，提示miRNA-210过表达对于改善梗死后心室重构也具有积极作用。
MiRNA-210过表达后可上调HGF表达，从而促进EC增殖、迁移，增加梗死区域内新生血管形成，减少心肌细胞坏死，改善心脏收缩功能。
参考文献
[1]阎 雪.循证护理在急性心肌梗死并发心律失常患者中的应用[J].中国循证心血管医学杂志，2016，8（8）：995-996.
[2]黄振华，叶 子，蒋 鹏，等.miRNAs在急性心肌梗死诊断中的研究进展[J].岭南心血管病杂志， 2017，23（3）：347-350.
[3]马诗语，王贤冬，王逸飞，等.miRNAs在心脏损伤和修复中的作用[J].现代医药卫生，2017，33（18）：2796-2799.
[4]马丽娟，高雅卿，刘 巍.循环miRNAs与心血管疾病的诊断[J].医学研究杂志，2017，46（9）：188-191.
[5]吴文皋，邓礼明，李林鹏，等.肝细胞生长因子在缺血性疾病的研究及进展[J].临床与病理杂志，2016，36（8）：1234-1238.
本文编辑：赵小龙
