孙璐+陆叶兰+简春燕+冯慧+陈明生+曹利军
[摘要] 目的 本文觀察胃泌素释放肽（GRP）受体（R）在肝缺血再灌注损伤模型中的表达情况，并探讨GRP及 GRPR拮抗剂RC-3095对小鼠肝缺血再灌注损伤是否具有保护作用。 方法 构建小鼠肝缺血再灌注损伤模型，将小鼠随机分为假手术组（sham组）、I/R再灌注后3 h组（3 h）、I/R 再灌注后6 h组（6 h）、I/R再灌注后 12 h组（12 h），观察GRP及 GRPR在缺血再灌注引起的肝损伤中的表达情况；然后将小鼠随机分为假手术组（sham组）、I/R组（I/R）、RC-3095干预组（RC-3095），HE染色观察小鼠肝组织坏死程度，检测各组小鼠外周血谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）水平，ELISA法检测小鼠外周血及肝脏组织中细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表达水平，RT-PCR法检测肝脏组织TLR4水平。 结果 小鼠肝脏缺血再灌注损伤GRP及GRPR表达增加，6 h达到高峰，随后表达降低；RC-3095能明显减轻肝缺血再灌注损伤模型小鼠肝脏坏死程度，抑制炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）的释放，抑制TLR4的表达。 结论 RC-3095可以通过抑制炎症因子的释放起到保护肝缺血再灌注损伤，其可能的机制是抑制TLR4的表达。
[关键词] 胃泌素释放肽受体；RC-3095；肝缺血再灌注损伤；TLR4
[中图分类号] R657.3 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2017）04-0037-04
Study on the effect of gastrin-releasing peptide receptor antagonist RC-3095 on reducing hepatic ischemia reperfusion injury in mice by inhibiting TLR4 pathway
SUN Lu LU Yelan JIAN Chunyan FENG Hui CHEN Mingsheng CAO Lijun
Department of Anesthesiology， No. 113 Hospital of PLA， Ningbo 315040， China
[Abstract] Objective To observe the expression of gastrin-releasing peptide （GRP） receptor （R） in the model of hepatic ischemia reperfusion injury， and to explore whether GRP and GRPR antagonist RC-3095 has a protective effect on hepatic ischemia reperfusion injury in mice. Methods The model of hepatic ischemia reperfusion injury in mice was established， and the mice were randomly divided into sham group， 3h group after I/R reperfusion group （3 h）， 6 h group after I/R reperfusion （6 h） and 12 h group after I/R reperfusion （12 h）. The expression of GRP and GRPR in hepatic injury induced by ischemia reperfusion was observed. The mice were then randomly divided into sham group （sham group）， I/R group （I/R） and RC-3095 intervention group （RC-3095）， and HE staining was used to observe the degree of liver necrosis in mice. AST and ALT levels at the peripheral blood were measured in mice in each group， and the expression levels of cytokines of TNF-α， IL-6 and IL-1β in peripheral blood and liver tissues were tested by ELISA. The level of TLR4 in liver tissue was tested by RT-PCR. Results It was found that GRP and GRPR expression was increased in the mice with liver ischemia reperfusion injury， and the expression level reached a peak at 6 h， followed by a decreased expression； RC-3095 could significantly reduce the degree of liver necrosis in mice with the model of liver ischemia reperfusion injury， inhibit the release of inflammatory factors（TNF-α， IL-6 and IL-1β） and inhibit the expression level of TLR4. Conclusion RC-3095 can protect hepatic ischemia reperfusion injury by inhibiting the release of inflammatory factors， and its possible mechanism is to inhibit the expression of TLR4.
[Key words] Gastrin-releasing peptide （GRP） receptor （R）； RC-3095； Hepatic ischemia reperfusion injury； TLR4
肝缺血再灌注损伤常见于肝脏外科手术、失血性休克等临床情况，目前研究证明，活性氧、趋化因子和炎性细胞因子，在其中发挥了重要作用，但具体的详细机制还不是十分清楚[1-3]。胃泌素释放肽（gastrin-releasing peptide，GRP）是一种体内活性神经肽，与其受体胃泌素释放肽受体（gastrin-releasing peptide receptor，GRPR）相互作用后可发挥多种生物学功能，已有研究表明GRP-GRPR在多种炎症性疾病中发挥关键作用，通过阻断GRP-GRPR反应可以抑制炎症发展，改善疾病的转归[4，5]。那么，GRP-GRPR通路在缺血再灌注引起的肝损伤中是否发挥作用，阻断GRP与GRPR通路能否减轻肝脏损伤？查阅国内外文献，相关的研究还未见明确报道。因此，本研究拟建立部分肝缺血再灌注损伤小鼠模型，观察GRP和GRPR在小鼠肝脏中的表达情况，探索GRPR拮抗剂RC-3095对小鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用，并初步探索其可能的作用机制。
l 材料与方法
1.1 仪器与试剂
1.1.1 动物 选取C57BL雄性小鼠，年龄6～7周，体重25 g左右，购自宁波大学医学院实验动物中心。
1.1.2 主要仪器 去离子水净水器（法国MILLIPORE公司），L500低速离心机（江苏其林贝尔仪器制作有限公司）。
1.1.3 主要试剂 RC-3095（美国Sigma公司），Trizol（日本Takara公司），ELISA试剂盒（美国R&D公司），RT-PCR试剂（日本TakaRa公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 实验模型建立 选取6～7周的C57BL健康雄性小鼠，本实验采用70%肝脏缺血再灌注小鼠模型。动物麻醉后，腹部消毒，沿小鼠腹部正中线剪开皮肤约1～2 cm，使用丝线从肝脏底部沿着肝门根部，活结结扎阻断左叶和中叶的供血，将活线线头留于腹腔外，缝合切口。待缺血1 h后抽离结扎线，实现再灌注。假手术组小鼠除不结扎肝门血管外，其余操作同模型组小鼠。
1.2.2 干预方法 ①观察GRP及 GRPR在缺血再灌注引起的肝损伤中的表达情况时，实验分组为：假手术组（sham组）、I/R再灌注后3 h组（3 h）、I/R 再灌注后6 h组（6 h）、I/R再灌注后 12 h组（12 h）。sham组在手术1 h后处死小鼠，其它各组分别于再灌注后3 h、6 h、12 h后处死小鼠。②在RC-3095干预时，实验分组：假手术组（sham组）、I/R组（I/R）、RC-3095干预组（RC-3095），根据第一部分GRP及 GRPR的表达情况，I/R组和RC-3095干预组选择GRP及 GRPR表达的峰值时间点处死小鼠。RC-3095干預组在造模手术前1 h通过小鼠尾静脉注射，剂量为3 μg/g，容积为100 μL。sham组和I/R组通过尾静脉注射100 μL生理盐水进行对照。
1.2.3 RC-3095的配制 RC-3095剂量为1 mg粉末，使用生理盐水进行稀释，配制成原始浓度为100 μg/200 μL。
1.2.4 GRP及GRPR表达的检测 获取肝脏组织后，制备匀浆液，然后实时聚合酶链反应（RT-PCR）法检测肝脏组织中GRP及GRPR的表达水平。
1.2.5 肝脏病理分析 获取肝脏组织，苏木精-伊红染色法（HE染色），镜检观察各组小鼠肝组织坏死程度。由病理科两位副主任医师读片并评分，评分标准：0分：无坏死；1分：个别细胞坏死；2分：小于30%的细胞坏死；3分：30%～60%细胞坏死；4分：大于60%的细胞坏死[6]。
1.2.6 外周血AST、ALT的检测 处死小鼠，心脏穿刺抽血，抽取完毕后，迅速转移到抗凝管中，全自动生化分析仪检测各组小鼠血清中谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）的水平。
1.2.7 外周血及肝脏炎症因子水平的检测 处死小鼠，心脏穿刺抽血，抽取完毕后，迅速转移到抗凝管中，酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测小鼠外周血TNF-α、IL-6、IL-1β的表达水平。获取肝脏组织后，制备匀浆液，RT-PCR法检测肝脏组织中细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表达水平。
1.2.8 RT-PCR法检测肝脏组织TLR4水平 处死小鼠，获取肝脏组织后，制备匀浆液，RT-PCR法检测肝脏组织中Toll样受体4（TLR4）水平。
1.3统计学方法
所有数据均用Gradphad Prism 5.0以及SPSS18.0软件进行统计学分析，计量资料均以均数±标准差（x±s）表示。符合正态分布及方差齐性的数据采用单因素方差分析比较多组间的差异，多组之间任两组间比较采用Dunnett检验；不符合正态分布或方差齐性两者任一条件的数据采用Kruskal Wallis非参数检验比较多组间差异，任两组间比较采用Dunnett检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 GRP及GRPR在肝缺血再灌注损伤中的表达情况
结果显示，GRP及GRPR在肝缺血再灌注损伤中的表达上调[GRP：I/R 3 h：（6000±124） pg/mL，I/R 6 h：（8700±167）pg/mL，I/R 12 h：（5560±98） pg/mL；GRPR：I/R 3 h：（3768±157）pg/mL，I/R 6 h：（5800±306）pg/mL，I/R 12 h：（4109±108）pg/mL]，而且在6 h达到高峰，随后表达水平降低。见图1。
2.2 RC-3095对缺血再灌注损伤肝脏病理影响
根据图1结果显示，GRP及GRPR表达高峰为再灌注后6 h，所以，I/R组及RC-3095干预组处死小鼠的时间为再灌注后6 h。光学显微镜下放大10倍观察，结果显示，sham组的肝组织结构正常；I/R组肝组织结构紊乱，出现大面坏死。而RC-3095干预组肝脏组织坏死程度较I/R组明显减轻，病理评分（1±1）分明显低于I/R组（3±1）分（P<0.05）。见封三图4。
2.3 RC-3095对缺血再灌注损伤外周血AST、ALT的影响
I/R组及RC-3095干预组处死小鼠的时间为再灌注后6 h。结果显示，与I/R 6 h组（ALT：2000±981 IU/L；AST：3200±870 IU/L）相比，RC-3095能显著降低外周血的转氨酶水平（ALT：190±98 IU/L；AST：550±120 IU/L）（P<0.01）。見图2。
2.4 RC-3095对缺血再灌注损伤外周血及肝脏细胞因子的影响
I/R组及RC-3095干预组处死小鼠的时间为再灌注后6 h。结果显示，在外周血中，与I/R 6 h组[TNF-α：（44.0±3.5）pg/mL；IL-6：（56.0±7.7）pg/m；IL-1β：（58.0±5.9）pg/m]相比，RC-3095组[TNF-α：（16.0±2.1 pg/mL）；IL-6：（22.0±4.7pg/m）；IL-1β：（17.0±3.5 pg/m）]的细胞因子的水平明显降低（P<0.01）；在肝组织中，与I/R 6 h组[TNF-α：（57.0±8.3 pg/mL）；IL-6：（76.0±9.2 pg/m）；IL-1β：（403.0±31.5） pg/m]相比，RC-3095组[TNF-α：（24.0±5.1）pg/mL；IL-6：（30.0±7.3）pg/m；IL-1β：（172.0±25.3）pg/m]的细胞因子的水平明显降低（P<0.01）。见图3。
2.5 RC-3095对肝脏组织TLR4水平的影响
I/R组及RC-3095干预组处死小鼠的时间为再灌注后6 h。结果显示，与I/R 6 h组（26.0±3.0 pg/mL）相比，RC-3095能显著抑制肝脏中TLR4表达水平[RC-3095组：TLR4：（13±4）pg/mL]。见图4。
3 讨论
肝缺血再灌注损伤是各种肝脏外科手术及危急症后引起肝脏功能异常的一个重要原因，是不同且复杂的机制共同作用的结果[1-3]。GRP具有广泛的生物学功能，GRP能够促进多种细胞因子的释放，参与免疫功能紊乱的调节以及炎症疾病的发生发展，研究证实，GRP-GRPR通路参与了多种疾病的进展过程[4，5]。在本研究中，GRP及GRPR在缺血再灌注引起的肝损伤中表达上调，由此推测GRP-GRPR通路可能参与了缺血再灌注损伤引起的肝损伤的发展过程。
为了验证上面的推论，本研究使用RC-3095来阻断GRP-GRPR通路，RC-3095是一种GRPR特异性的阻断剂，研究证实，其能在多种疾病中具有抑制炎症反应的功能[7-9]。在目前的研究中普遍应用肝功能及肝组织病理切片是评估肝损伤程度，本研究结果显示，与Sham相比，I/R组的转氨酶（AST、ALT）明显升高，而RC-3095干预组的转氨酶明显降低；病理切片显示，与I/R组相比RC-3095干预组的肝组织损伤明显减轻。这些结果一方面暗示GRP-GRPR通路参与了缺血再灌注引起的肝损伤的疾病进展过程，另一方面也提示RC-3095能明显减轻缺血再灌注损伤引起的肝损害。
以前的文献显示，促炎因子在缺血再灌注引起的肝损伤的疾病进展过程中发挥了重要作用[10-13]。Godwin A等[14]应用冷诱导RNA结合蛋白预处理方法，抑制炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达，从而达到减轻的肝脏的损伤。Colletti LM等[15]研究通过抑制TNF-α的表达，发现缺血再灌注损伤引起的肝损伤显著缓解。研究发现，GRP作为一种神经肽物质，也是一种内源性的炎性介质，可通过与GRPR的相互作用参与炎性反应，这种作用与IL-1β、IL-6、TNF-α密切相关[16]。本研究发现，使用RC-3095阻断GRP-GRPR通路后，IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平明显降低，这些结果表明RC-3095可能通过抑制炎症因子的表达来起到保护缺血再灌注引起的肝损伤的作用。
前面已经证实了RC-3095可以抑制炎症因子的表达，为了进一步的探究其中的可能机制，本研究检测了肝脏组织中TLR4的表达水平。TLR4受体是一种免疫受体，广泛表达于库普弗细胞，肝细胞，肝星状细胞，胆管上皮细胞，窦状内皮细胞和肝脏树状细胞（DCs）上，文献发现，TLR4在炎症反应中发挥重要的调节作用[17-19]。一项最近的研究证实，在肝脏大面积坏死的模型中，敲除TLR4基因小鼠的炎症因子释放受到抑制，并且肝脏坏死的程度明显减轻，提示TLR4途径在肝脏炎症反应中发挥了重要作用[20]。本研究也显示肝缺血坏死模型中TLR4的表达显著升高，同时也证实RC-3095能明显抑制肝缺血再灌注损伤TLR4表达，此结果提示RC-3095保护缺血再灌注引起的肝损伤可能是通过抑制TLR4表达，从而降低炎症因子的表达来实现的。
综上所述，本研究提示GRP-GRPR通路参与了肝缺血再灌注损伤的疾病进展过程，同时也揭示了RC-3095减轻肝损伤可能是通过抑制TLR4表达，从而降低炎症因子的表达来实现的，为以后RC-3095治疗肝缺血再灌注损伤提供了一定的理论依据。另外，本研究还是存在一定的缺陷，首先，未对TLR4介导的信号通路具体机制进行研究阐述，另外，TLRs受体家族种类很多，本研究只对其中一种受体进行了初步探讨，而未涉及其它受体，存在一定的局限性；其次，因为缺血再灌注损伤的病理生理十分复杂，本实验只观察了某一通路的作用，这些并不能非常清楚的解释RC-3095保护作用详细机制，还需进一步的阐述其它信号通路在其中的作用。
[參考文献]
[1]Vollmar B，Glasz J，Leiderer R，et al. Hepatic microcirculatory perfusion failure is a determinant of liver dysfunction in warm ischemia-reperfusion[J]. Am J Pathol，1994，145（6）：1421-1431.
[2]Marzi I，Takei Y，Rücker M，et al. Endothelin-1 is involved in hepatic sinusoidal vasoconstriction after ischemia and reperfusion[J]. Transpl Int，1994，7 Suppl 1：S503-S506.
[3]Jaeschke H，Farhood A，Smith CW. Neutrophils contribute to ischemia/reperfusion injury in rat liver in vivo[J].FASEB J，1990，4（15）：3355-3359.
[4]Dal-Pizzol F，Di Leone LP，Ritter C，et al. Gastrin-releasing peptide receptor antagonist effects on an animal model of sepsis[J]. Am J Respir Crit Care Med，2006，173（1）：84-90.
[5]Grimsholm O，Rantap？覿？覿-Dahlqvist S，Forsgren S. Levels of gastrin-releasing peptide and substance P in synovial fluid and serum correlate with levels of cytokines in rheumatoid arthritis[J]. Arthritis Res Ther，2005，7（3）：R416-R426.
[6]Chen M，Cao L，Luo Y，et al. Paeoniflorin protects against concanavalin A-induced hepatitis in mice[J]. Int Immunopharmacol，2015，24（1）：42-49.
[7]伍素霞，惠复兴. 胃泌素释放肽受体拮抗剂RC-3095对大鼠肺组织纤维化的干预作用[J].中国老年学杂志，2015，11（35）：6039-41.
[8]Hong SK，Yang SY，Yin SH，et al. RC-3095，a gastrin-releasing peptide receptor antagonist， synergizes with gemcitabine to inhibit the growth of human pancreatic cancer CFPAC-1 in vitro and in vivo[J]. Pancreas，2014， 43（1）：15-21.
[9]Oliveira PG，Grespan R，Pinto LG，et al. Protective effect of RC-3095， an antagonist of the gastrin-releasing peptide receptor，in experimental arthritis[J]. Arthritis Rheum，2011，63（10）：2956-2965.
[10]Feng M，Li G，Qian X，et al. IL-17A-producing NK cells were implicated in liver injury induced by ischemia and reperfusion[J]. Int Immunopharmacol，2012，13（2）：135-140.
[11]MacParland SA， Ma XZ， Chen L， et al. Lipopolysaccharide and Tumor Necrosis Factor Alpha Inhibit Interferon Signaling in Hepatocytes by Increasing Ubiquitin-Like Protease 18（USP18） expression. J Virol. 2016，90（12）：5549-5560.
[12]Bal A，Gonul Y，Hazman O，et al. Interleukin 18--binding protein ameliorates liver ischemia--reperfusion injury[J]. J Surg Res，2016，201（1）：13-21.
[13]Longo L，Sinigaglia-Fratta LX，Weber GR，et al. Hypothermia is better than ischemic preconditioning for preventing early hepatic ischemia/reperfusion in rats[J]. Ann Hepatol，2016，15（1）：110-120.
[14]Godwin A，Yang WL，Sharma A，et al. Blocking cold-inducible RNA-binding protein protects liver from ischemia-reperfusion injury[J]. Shock，2015，43（1）：24-30.
[15]Colletti LM，Green M. Lung and liver injury following hepatic ischemia/reperfusion in the rat is increased by exogenous lipopolysaccharide which also increases hepatic TNF production in vivo and in vitro[J]. Shock，2001， 16（4）：312-319.
[16]Czepielewski RS，Porto BN，Rizzo LB，et al. Gastrin-releasing peptide receptor（GRPR） mediates chemotaxis in neutrophils[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2012，109（2）：547-552.
[17]Takeuchi O，Akira S. Pattern recognition receptors and inflammation[J]. Cell，2010，140：805-820.
[18]Yang H，Zhou H，Zhuang L，et al. Plasma membrane-bound G protein-coupled bile acid receptor attenuates liver ischemia/reperfusion injury via the inhibition of toll-like receptor 4 signaling in mice[J]. Liver Transpl，2017，23（1）：63-74.
[19]Kadono K，Uchida Y，Hirao H，et al. Thrombomodulin attenuates inflammatory damage due to liver ischemia and reperfusion injury in mice in toll-like receptor 4-dependent manner[J]. Am J Transplant，2017，17（1）：69-80.
[20]Xu J，Zhang X，Monestier M，et al. Extracellular histones are mediators of death through TLR2 and TLR4 in mouse fatal liver injury[J]. J Immunol，2011，187：2626-2631.
（收稿日期：2016-11-9）
