孙晶 郭阁 于堂 张璇
[关键词] 大鼠;β-防御素-2;牙龈上皮;中药
[中图分类号] R781.4 [文献标识码] A [文章編号] 1673-9701（2021）22-0032-03
Screening of Chinese herbal medicine for inducing expression of β-defensin-2 in gingival epithelium
SUN Jing1 GUO Ge1 YU Tang2 ZHANG Xuan3
1.Department of Children′s Stomatology， Changsha Stomatological Hospital， Changsha 410000， China; 2.Department of Stomatology， Ji′ning First People′s Hospital in Shandong Province， Jining 272000， China; 3.Department of Children′s Stomatology， the Second Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University， Jinzhou 121000， China
[Abstract] Objective To screen out the Chinese herbal medicine which can induce the expression of β-defensin-2 in rat gingival epithelium. Methods 90 rats in our hospital from February 2019 to April 2020 were selected as the research objects. Ninety healthy adult Wistar rats were randomly divided into three groups： the inherent expression group （10 rats）， the negative control group （10 rats） and the positive control group （10 rats）. The experimental group were given drugs respectively （the astragalus membranaceus group， the Radix Isatidis group， the salvia miltiorrhiza group， the radix bupleuri group， the herba houttuyniae group， and the andrographolide lactone group， with 10 rats in each group， a total of 60 rats）. After 7 days of continuous administration， the rats were sacrificed， and the gingival epithelium of the rats was cut. The expression of β-defensin-2 protein in the gingival epithelium of the rats was detected by the immunohistochemical method. Results The expressions of β-defensin-2 protein in the gingival epithelium of rats in the astragalus membranaceus group and the radix isatidis group were significantly higher than that in the inherent expression group， and the differences were statistically significant（P<0.05）， but no statistically significant differences were observed compared with the positive control group（P>0.05）. Conclusion Astragalus membranaceus and radix isatidis can induce the increase of β-defensin-2 expression in the gingival epithelium of rats， suggesting that astragalus membranaceus and radix isatidis can regulate the innate immunity of oral mucosa of rats.
[Key words] Rat; β-defensin-2; Gingival epithelium; Chinese herbal medicine
现今因抗生素滥用而引起的病原微生物耐药、过敏反应、正常菌群失调等问题日趋严重，研究和开发内源性肽类抗生素已备受医学界关注。防御素是现今研究中最受关注的内源性肽类抗生素分子，具有抗细菌、抗病毒、抗真菌、抗肿瘤等多种生物学活性，并且尚未发现有耐药菌的产生[1-2]。哺乳动物类防御素按其结构不同可分为α-防御素、β-防御素和θ-防御素三种。在哺乳动物口腔中，β-防御素主要分布于上皮细胞内，是宿主口腔天然免疫系统的重要组成部分，与多种口腔感染性疾病密切相关。研究表明，β-防御素受LPS、TNF-α、IL-1α、IL-1β等炎症因子的诱导表达[3-5]，而用于治疗感染性疾病的中药能够增强机体免疫能力，但其作用机制尚不明确，把β-防御素作为筛选抗菌中药或其有效成分作为新的研究方向，可以增加中药药效的物质基础，甚至还可能为解释中药抗感染机制提供新的依据[6]。本实验期望筛选出相关中药，可以为β-防御素-2基因表达的研究提供实验依据，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物
SPF级Wistar大鼠90只，雌雄不限，体重约为200 g（第三军医大学实验动物中心），许可证号SCXK（渝）2012-0005。
1.2 药物与试剂
黄芪注射液（大理药业股份有限公司，国药准字Z53021677）;板蓝根注射液（湖北天圣康迪制药有限公司，国药准字Z42020394）;鱼腥草注射液（南阳利欣药业有限公司，国药准字Z41021628）;丹参注射液（正大青春宝药业有限公司，国药准字Z33020177）;柴胡注射液（河南福森药业有限公司，国药准字Z41020743）;穿心莲内酯注射液（江西青峰药业有限公司，国药准字Z20026249），LPS脂多糖（Sigma，USA L2880）;Rabbit Anti-beta2 Defensin（bs-1296R，北京博奥森）;SP-Kit（Rabbit）（SP-0023，北京博奥森）。
1.3 动物分组
2019年2月至2020年4月选取90只大鼠作为研究对象。大鼠均为同族，90只健康Wistar大鼠，适应性喂养1周，随机分为九组，每组10只：固有表达组（不予特殊处理）、阴性对照组（生理盐水0.5 mL/次）、阳性对照组（LPS 2.00 mL/kg）、黄芪组（2.50 mL/kg）、板蓝根组（2.50 mL/kg）、丹参组（2.50 mL/kg）、柴胡组（2.50 mL/kg）、鱼腥草组（2.50 mL/kg）、穿心莲内酯组（2.50 mL/kg）。根据《中药药理实验方法学》临床用药的体重计算方法，按照《医学实验动物学教程》中动物与人体每千克体重剂量折算系数进行换算，200 g大鼠的剂量（mg/kg）=W×60 kg人的剂量（mg/kg），折算系数W=6.25;以此换算出大鼠用药剂量，各组均采用大鼠尾静脉注射方式给药，连续给药7 d，每天一次。
1.4 标本采集
于第7天给药24 h后断颈处死大鼠，手术剥离切除前牙至磨牙段牙龈组织，PBS缓冲液冲洗3次后，经4%多聚甲醛固定、0.3%Triton X-100通透化处理、3% H2O2灭活内源性过氧化物酶和山羊血清白蛋白封闭后，滴加一抗（1∶200），4℃湿盒内孵育过夜，次日滴加二抗（生物素标记的羊抗兔IgG），37℃孵育30 min，滴加SABC试剂，37℃孵育30 min，DAB法显色，镜下观察显色情况，苏木素复染，脱水，封片。
1.5 结果判定
各组苏木素复染细胞核后，细胞核呈蓝色，β-防御素-2蛋白表达以棘细胞层和颗粒层细胞胞浆呈现淡黄色至棕黄色颗粒者为阳性;阴性组用PBS代替一抗，胞浆不被DAB染色;根据染色的强弱判断结果，于高倍镜下随机选取10个视野进行拍照，在采集图像时，不更改曝光时间、增益、彩色饱和度等。以Image-Pro Plus 6.0软件进行染色强弱及染色面积的判断，做平均光密度值的半定量分析[7]。选择免疫组织化学方法进行检验。
1.6 统计学方法
实验所有数据使用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料不同时间对比应用重复测量的方差分析，结果以（x±s）表示，各组间比较采用配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 免疫组织化学法检测β-防御素-2蛋白表达结果
以PBS代替一抗的阴性组细胞胞浆无染色;空白对照组、阴性对照组、丹参组、柴胡组、鱼腥草组及穿心莲组上皮棘细胞及粒细胞胞浆呈少量染色，视为阴性表达;阳性对照组、黄芪组、板蓝根组胞浆呈黄色或棕黄色染色，视为阳性表达。见封三图1。
2.2 免疫组织化学染色深浅的平均光密度值检测
黄芪组、板蓝根组及阳性对照组大鼠牙龈上皮组织β-防御素-2蛋白表达水平较高，与固有表达组比较，差异有统计学意义（P<0.05），各组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）;丹参组、柴胡组、鱼腥草组、穿心莲組β-防御素-2蛋白表达水平较低，与固有表达组及各组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1、封三图2。
3 讨论
天然的防御素是内源性抗生素肽家族中最大的亚家族，几乎分布于所有的生物类群中，是生物长期与疾病斗争中进化而来的，构成自身防御体系的重要组成部分。β-防御素-2（β-defensin-2，BD-2）是第一个在人体中被发现的呈诱导性表达的防御素。其不受耐药菌株的影响，具有抗菌、抗病毒、免疫调节及细胞毒等作用，在口腔上皮宿主防御及免疫应答过程中发挥着重要作用，与多种口腔疾病关系密切[3-5]。
本实验在选取中药的过程中，主要从其功效主治出发，在具有抗炎、抗病毒及免疫调节等作用的中药类别中选取了黄芪、板蓝根、丹参、柴胡、鱼腥草、穿心莲等具有临床基础、与β-防御素-2作用相似的中药单体6种作为筛选对象。其中选取样本中原有的10只经研究后未死亡的大鼠，结果发现中药黄芪和板蓝根能够诱导大鼠牙龈上皮组织中β-防御素-2的表达增高，提示黄芪和板蓝根具有调节大鼠口腔黏膜天然免疫的作用，其作用可能与诱导内源性抗生素肽的高效表达相关。马艳等[6]在中药黄芪诱导防御素的研究中发现，黄芪有可能是通过启动机体的抗感染机制，如诱导先天性免疫分子防御素的分泌而发挥抗菌作用的[7]。陈铁等[8]利用板蓝根诱导肺上皮细胞β-防御素-2的研究中发现，板蓝根能够刺激IL-1、IL-2和TNF-α等细胞因子的产生，进而实现β-防御素-2表达上调，增强机体抵抗力而达到抗菌目的，这与本实验结果一致[9-10]。而实验中丹参、柴胡、鱼腥草及穿心莲内酯对大鼠牙龈上皮β-防御素-2无明显的诱导表达作用，可能与本实验的给药剂量、给药途径及作用时间等因素有一定的关系，不能排除其诱导β-防御素-2表达的可能性;也可能与中药多靶点、多系统的广泛药理作用及药物在体内的代谢不同有关，有待进一步的实验探究[11-12]。
β-防御素-2的研究为抗感染提供一个新的思路，为对抗耐药微生物带来了新的契机[13-15]。由于β-防御素-2不易获得，同时生产的成本也比较高，其临床应用受到了一定的限制[16]。而中药黄芪和板蓝根可以诱导大鼠牙龈上皮组织中β-防御素-2的表达增加，提示笔者可以尝试利用这两种中药来增强牙龈组织局部的抗感染能力，以消除病原微生物的作用，这也将可能成为中药抗感染的机制之一。
就目前研究来说，使用中药对口腔上皮β-防御素-2在合适的范围中表达达到抗损和损伤平衡机制并不清楚。纳入研究的中药种类较少，并且大多数会局限单味药以及有效的成分或者以中成药比较多，传统的复方汤剂中的中药形式比较少。防御素-2属于固有免疫重要组成成分，社体自身属于活性物质，不具有免疫原性，抗菌谱广并且难以抗性突变，可以替代抗生素作为人类的全新抗感染治疗方式，前景较为广阔。使用中药比其他诱导剂价格更低，安全性更高。所以需要更加深入的研究，从而为人类谋取福利。
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（收稿日期：2021-3-31）
