滕淑 赵仕勇 陈海哨 宋闻 黄笑笑 蒋茂莹 林先耀
[关键词] 手足口病;柯萨奇病毒感染;脱甲;基因型
[中图分类号] R181.2 [文獻标识码] A [文章编号] 1673-9701（2021）21-0005-06
Analysis of related factors and gene of Coxsackie virus group A type 6 HFMD complicated with onychomadesis
TENG Shu ZHAO Shiyong CHEN Haishao SONG Wen HUANG Xiaoxiao JIANG Maoying LIN Xianyao
Department of Pediatric Infectious Diseases， Hangzhou Children′s Hospital， Hangzhou 310014，China
[Abstract] Objective To understand the related factors of Coxsackie virus group A type 6 （CA6） hand-foot-mouth disease （HFMD） complicated with onychomadesis， and analyze the genetic characteristics of CA6， so as to provide scientific basis for clinical diagnosis and treatment， and developing prevention and control measures. Methods A total of 59 children with CA6 HFMD who were hospitalized in Hangzhou Children′s Hospital from September 2017 to June 2018 were collected for a follow-up study on their onychomadesis.And 15 children were randomLy selected for CA6 VPl gene sequencing to construct phylogenetic tree for homologous alignment analysis and evolutionary analysis. Results Of the 59 children， 42 were successfully followed up， and 17 were lost to follow-up， with a loss to follow-up rate of 28.8%. Of the 42 children who were successfully followed up， 16 cases （38.1%） had onychomadesis， and 26 cases （61.9%） had none. The mean time of CA6 children patients was （32±9）days after acute infection. No significant differences were observed in the viral load， immunoglobulin G， immunoglobulin A，immunoglobulin M， T lymphocyte proportions， helper T cell proportions， inhibitory/cytotoxic T cell proportions， B lymphocyte proportions， NK cell proportions between the onychomadesis group and the non-onychomadesis group（P>0.05）. The homology comparison and evolutionary analysis of CA6 VPl gene showed that the nucleotide homology of 15 CA6 gene sequences was 91.1% to 99.9%， among which 3 were C genotype and the other 12 were D3 genetic subtype. Conclusion In children with CA6 HFMD， onychomadesis is more common in the 5th week after onset. The occurrence of onychomadesis has nothing to do with the viral load of the children. The CA6 strain in this study belongs to C genotype and D3 genetic subtype， of which D3 genetic subtype is the dominant type.
[Key words] Hand-foot-mouth disease （HFMD）; Coxsackie virus infection; Onychomadesis; Genotype
手足口病是一种儿童常见传染病。自2013年开始，我国多个地区的手足口病的优势病原体逐渐由肠道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）、柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16，CA16）转变为柯萨奇病毒A组6型（Coxsackievirus A6，CA6）[1-3]。基于CA6不断上升的流行趋势，故密切监测CA6病毒的基因特征，对手足口病的防治具有重要意义。CA6感染的手足口病患儿与EV71或CA16感染的手足口病患儿相比，有其特异性的临床特征：病情相对较轻，皮肤损害程度较重，易出现大疱或大囊泡样皮疹，且远期发生脱甲症的机率较高[4-5]。但目前手足口病并发脱甲症的发病机制及影响因素尚不明确。为了进一步了解CA6型手足口病并发脱甲症的影响因素，监测CA6毒株的基因特征及流行发展趋势，本研究对CA6型手足口病并发脱甲症的相关因素进行分析，并对CA6病毒衣壳蛋白（Virus protein，VPl）基因序列进行测定及系统进化分析，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
随机收集2017年9月至2018年6月在杭州市儿童医院接受治疗的CA6感染手足口病患儿59例，对其脱甲情况进行随访研究。并从59例患儿中随机挑选15例进行CA6 VPl基因序列测定及系统进化分析。本研究已获得医院医学伦理委员会批准[伦理审查批件号：（2019）年伦理（临研）第（21）号]，并已取得所有患儿家长的知情同意。
纳入标准[6]：①符合卫生部颁布的《手足口病诊疗指南（2018年版）》的手足口病诊断标准[7]。②实验室检测为CA6肠道病毒核酸阳性。③征得患儿家长知情同意。排除标准[8]：①同时存在其他肠道病毒感染者。②由系统性疾病、外伤及药物引起脱甲的病例。
1.2 临床资料收集
收集患儿的临床资料，包括年龄、性别、发病时间、院外病程、皮肤过敏史、发热持续时间、体温高峰、临床表现、住院时间、血糖、血常规、C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、降钙素原、病毒载量、免疫球蛋白、淋巴细胞亚群。
1.3 随访
所有患儿在出院后，由专职的护士定期（每周1次）电话联系患儿家属进行随访。自患儿出院后，总共随访8周。随访内容包括：①是否发生脱甲;②甲脱落的时间、部位、受累甲的数量。
1.4 病毒核酸检测方法
①采集所有患儿入院当天的咽拭子样本，提取病毒核酸。②使用肠道病毒三联实时荧光定量反转录-聚合酶链反应（Real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）检测试剂盒（中山大学达安基因股份有限公司），在ABI 7500荧光定量PCR仪（ABI公司，美国）上进行肠道病毒通用型核酸、EV71病毒核酸、CA16病毒核酸的定量（拷贝/mL）检测。以1×107、1×106、1×105、1×104、1×103等5个滴度做一条标准曲线，分别以1×107和1×103两个滴度作为质控。检测结果以>1×103为阳性，具体操作按说明书进行。聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）扩增条件为：42℃、25 min，1个循环;94℃、3 min，1个循环;93℃、 30 s，55℃、45 s，40个循环。当肠道病毒通用型核酸检测阳性，而EV71病毒核酸及CA16病毒核酸检测均阴性时，则确定为非EV71、CA16的其他肠道病毒感染。③对实验室确诊为非EV71、CA16的其他肠道病毒感染的患儿，通过手足口病肠道病毒CA6和柯萨奇病毒A组10型（Coxsackievirus A10，CA10）核酸双通道检测试剂盒（江苏硕世生物）进行CA6病毒定量检测。所有操作严格按照说明书进行。
1.5 CA6 VP1基因扩增及测序
针对CA6 VPl基因设计特异性引物：上游引物TTAGGGCGGTTAAGACTGGA;下游引物GGCACCCAAGCTCTCACGTG，使用Invitrogen公司one step RT-PCR for long template试剂盒结合该引物对随机挑选的15份CA6阳性标本的VPl基因进行扩增。反应体系按照试剂盒说明书中所推荐反应体系配置，具体反应条件为：42℃反转录45 min，95℃变性5 min;94℃预变性2 min;95℃变性1 min，45℃退火1 min，68℃延伸1 min 30 s，共40个循环;72℃延伸10 min。将扩增产物在20 g/L琼脂糖凝胶中进行鉴定。PCR阳性产物送上海生工公司进行纯化和双向测序。
1.6 CA6 VP1基因序列同源性和进化分析
利用DNAstar 7.1软件对VPl序列进行同源性比对。并从GenBank下载27条国内其他省（市）和其他国家或地区有代表性的全长VP1区序列，与本研究中所测的15條CA6 VP1基因序列合并为1个数据集。用MEGA 7.0软件进行VPl序列比对和进化分析，采用邻接法（Neighboring-joining）及Kimura-2-Parameter模式构建系统进化树，建树的可靠性通过1000 bootstrap值评估。
1.7 统计学方法
采用SPSS 16.0统计学软件进行统计处理。计量资料首先进行数据的正态检验，符合正态分布的用均数±标准差（x±s）表示;非正态分布的用中位数（四分位数间距）[M（Q1，Q3）]表示。计数资料用[n（%）]表示。两组间计量资料的比较采用t检验（正态分布时）或秩和检验（非正态分布时）;两组间计数资料的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 患儿的一般资料
59例CA6型手足口病患儿，男38例，女21例，性别比为1.81∶1;发病年龄为16（10，31）个月。所有患儿均为普通型手足口病。59例患儿均出现发热（100.0%），发热持续时间为3（2，3）d;9例患儿出现惊厥（15.2%）。59例患儿的咽拭子CA6病毒载量为6×106（0.3×106， 30×106）拷贝/mL。所有患儿均治愈出院。
2.2 患儿脱甲随访情况
59例患儿中，42例患儿完成脱甲随访工作，17例患儿失访，失访率（28.8%）。42例成功随访患儿中，16例出现脱甲（38.1%），26例未出现脱甲（61.9%）。CA6患儿的脱甲发生于急性感染后14～49 d;平均脱甲时间为急性感染后的（32±9）d。脱甲数量为1～12个，脱甲数量的中位数为4个。16例脱甲患儿中，仅手指脱甲者14例（87.5%），手指和脚趾均脱甲者2例（12.5%）。
2.3 CA6脱甲组与CA6非脱甲组的临床指标比较
42例成功随访的患儿，根据有无脱甲，分为脱甲组与非脱甲组。两组患儿的性别、年龄比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。两组间的皮肤过敏史、热峰、发热持续时间比较，差异无统計学意义（P>0.05）。两组患儿咽拭子标本的病毒载量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。两组间降钙素原、外周血白细胞计数、CRP、免疫球蛋白G、免疫球蛋白A、免疫球蛋白M、T淋巴细胞比例、辅助T细胞比例、抑制/细胞毒性T细胞比例、B淋巴细胞比例、自然杀伤细胞（Natural killer cell，NK）比例比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
2.4 CA6病毒同源性分析及系统进化分析
将15条CA6 VP1基因序列与GenBank中27条代表性的全长VP1序列进行系统进化分析，构建系统进化树。参照文献[9-10]，根据进化树上各CA6序列的亲疏关系，将42条CA6序列分为A、B、C、D四个基因型（图1）。D基因型所含的序列数最多，它可进一步分为3个基因亚型（D1、D2、D3）。本研究中15条CA6基因序列的核苷酸同源性为91.1%～99.9%。15条CA6基因序列中，有3条序列属于C基因型，其余12条序列均属于D3基因亚型。12条D3基因亚型序列与2013年中国长春株KT779411（ChangChun/CHN/2013）、2016年澳大利亚株MH111034（CHW/AUS/2016）亲缘关系较近，核苷酸同源性分别为94.3%～96.3%、94.2%～96.0%。3条C基因型序列与2014年中国深圳株KX595286（SZ/CHN/2014）、2014年英国株KP144343（Gla/UK/2014）亲缘关系较近，核苷酸同源性分别为92.8%～94.2%、91.9%～93.1%。15条CA6基因序列与1949年美国CA6原始株AY421764（Gdula/USA/1949）、2011年土库曼斯坦株LR027552（TKM/2011）亲缘关系较远，其核苷酸同源性为80.1%～83.7%。
在这15条CA6基因序列所对应的15例手足口病患儿中，有5例患儿完成了脱甲随访工作，4例出现脱甲，1例未出现脱甲。这5例患儿的CA6基因均属于D3基因亚型。
3 讨论
自2008年芬兰开始，CA6病毒在多个国家和地区引起手足口病的暴发[11-12]，亦成为手足口病的常见病原体之一。尤其值得关注的是，CA6引起的手足口病易发生非典型皮疹和脱甲症[13]。脱甲症是一种无痛性、非炎症性甲异常，表现为近端甲板自甲母质和甲床分离[14]。近年来，研究发现脱甲症与手足口病密切相关，现普遍认为脱甲症是手足口病的远期并发症[13]。
本研究对CA6感染的手足口病患儿的脱甲情况进行随访，结果显示，CA6型手足口病患儿脱甲的发生率为38.1%，与申洁等[15]的研究报道数据基本相符。但邓慧玲等[5]的研究显示CA6感染的手足口病患儿中脱甲的发生率为25.1%。而李娟娟等[8]报道显示CA6型手足口病脱甲发生率为44.64%。这两项文献报道与本研究报道数据不完全一致，考虑可能与研究地区、研究人群不同有关。
本研究显示，CA6感染患儿发生脱甲的平均时间为急性感染后的（32±9）d。这与关君艳等[16]及颜湘等[17]的研究结论“CA6感染患儿脱甲时间主要集中在手足口病急性感染后第5周”基本一致。此外，本研究显示，CA6型手足口病并发脱甲症的患儿中，手指甲脱甲所占的比例高于脚趾，这与李娟娟等[8]的研究结论一致。其原因考虑可能与手指指甲的生长速度高于脚趾，病毒诱导的甲基质破坏对手指的影响大于脚趾有关。
迄今为止，手足口病并发脱甲症的发病机制尚不明确。Chiu等[18]在手足口病患儿脱落的指甲样本中检测到CA6，从而推测脱甲可能与CA6病毒导致甲基质破坏有关。有学者推测脱甲可能与甲床炎症的继发性改变或甲床浸渍于疱疹液有关[19]。亦有学者推测手足口病病毒可能会引起机体免疫反应，从而导致甲母质细胞成熟过程中断，甲母质的功能受到抑制，最终出现指甲脱落[20]。
目前CA6型手足口病患儿恢复期的指（趾）甲脱落与其病毒载量、急性感染期的免疫功能状态是否存在相关性尚不明确;且相关的文献报道较少。本研究显示脱甲组与非脱甲组之间的咽拭子标本病毒载量、体液免疫功能指标（免疫球蛋白G、免疫球蛋白A、免疫球蛋白M）、细胞免疫功能指标（T淋巴细胞比例、辅助T细胞比例、抑制/细胞毒性T细胞比例、B淋巴细胞比例、NK细胞比例）比较，差异无统计学意义。这提示CA6型手足口病患儿脱甲症的发生与患儿的CA6病毒载量、急性感染期的体液免疫功能及细胞免疫功能状态无关。
本研究亦显示，CA6型手足口病患儿脱甲症的发生与患儿的热峰、发热持续时间无关，这与李恒君等[21]、谢立雪等[22]的研究报道一致。
近年来，随着分子生物学中病毒基因分型技术的进展，人们对手足口病病毒有了新的认识。CA6的病毒基因组为单股正链核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA），P1区编码4种结构蛋白（VP1～VP4）。VP1蛋白是肠道病毒最重要的衣壳蛋白，含有抗原定位点和受体识别表位，具有与病毒血清型对应的遗传多态。故VP1基因是肠道病毒基因分型和遗传进化分析的重要基因，常作为进化分析的标准[23]。
目前对于CA6基因型和基因亚型，国内外尚无统一的分型标准。本研究参考国际上EV71的基因分型标准[24]，并参照文献[9-10]根据VPl基因构建CA6的系统进化树，将其划分为A、B、C、D等四个不同基因型。从图1可以看出各基因型具有显著的时空分布与进化规律。本研究中15条CA6基因序列的核苷酸同源性较高（91.1%～99.9%）;其CA6毒株分别属于C基因型、D3基因亚型，其中D3基因亚型为优势型别。这也说明D3基因亚型对本次CA6流行起关键作用。这与Song等[10]研究报道称近年来中国大陆所流行的CA6主要为D3亚型相符。
本研究中，12条D3基因亚型序列与2013年中国长春株KT779411、2016年澳大利亚株MH111034亲缘关系较近。这提示本研究中的CA6毒株D3基因亞型可能与2013年中国长春CA6代表株、2016年澳大利亚CA6代表株来源于同一传播链，存在着一定进化关系。3条C基因型序列与2014年中国深圳株KX595286、2014年英国株KP144343亲缘关系较近，这提示本研究中的CA6毒株C基因型可能来源于2014年的中国深圳及英国CA6代表株。
目前CA6型手足口病脱甲的发生与CA6的基因分型是否相关尚不明确。本研究检测了15条CA6基因序列，这15条CA6基因序列所对应的15例手足口病患儿中，有5例患儿完成了脱甲随访工作：4例脱甲，1例未脱甲。这5例患儿的CA6基因均属于D3基因亚型。因研究例数较少，脱甲症与CA6基因分型的关系，有待进一步扩大样本量进行研究。
综上所述，CA6型手足口病患儿易发生脱甲，脱甲发生时间多集中于手足口病发病后第5周。故对于CA6型手足口病患儿，临床诊治过程中要提前做好脱甲症相关知识宣教工作，从而减轻脱甲症发生时患儿家属的焦虑情绪。本研究进一步评估CA6病毒载量的临床应用价值：CA6型手足口病患儿的病毒载量高低与脱甲症的发生与否无关。此外，本研究初步掌握了CA6毒株的VP1基因片段的遗传进化特征，研究显示D3基因亚型为优势型别。这为CA6病毒的遗传进化和流行规律积累部分基础数据，为手足口病防控提供科学依据。但因本研究的样本量偏小，失访率偏高，其结果存在一定局限性，仍需大样本进一步研究。
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（收稿日期：2020-11-03）
