蔡莺莺 石庆新 周秋菊 丁仙红 陈佳喜 涂茜 王冬莲
[关键词] 结核病;异烟肼;利福平;耐药基因
[中图分类号] R446.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2021）20-0146-04
Epidemiological investigation of resistance genes of rifampicin and isoniazid of Mycobacterium tuberculosis in Taizhou area
CAI Yingying1，2 SHI Qingxin1，2 ZHOU Qiuju1，2 DING Xianhong1，2 CHEN Jiaxi1，2 TU Xi1， 2 WANG Donglian1，2
1.Department of Clinical Laboratory，Taizhou Hospital of Zhejiang Province，Linhai 317000，China;2.Department of Clinical Laboratory，Enze Hospital of Taizhou Enze Medical Center，Taizhou 318053，China
[Abstract] Objective To understand the phenotype of resistance genes of rifampicin and isoniazid of Mycobacterium tuberculosis prevalent in Taizhou area，and to provide evidence for effective treatment of tuberculosis. Methods A total of 482 clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis strains sent to and examined in Enze Hospital of Taizhou Enze Medical Center （Group） from August 2015 to November 2020 were analyzed retrospectively.Rifampicin resistance related gene in rpoB， isoniazid resistance related genes in katG and inhA were detected in specificity by DNA microarray chip method. Results In 482 cases of Mycobacterium tuberculosis， 367 cases of rpoB wild type and 115 cases of rpoB mutation-type were detected in rifampicin resistance gene， in which rpoB531（C→T） mutation was the main mutation-type，and 55 cases were detected. 372 cases of katG and InhA wild-type and 110 cases of mutation-type were detected in isoniazid resistance gene. In katG gene mutants， 91 cases were katG315（G→C） mutation and 12 cases were katG315（G→A） mutation. There were only 16 cases of inhA-15（C→T） mutation in inhA gene mutants. In 2020， the resistance rate of rifampicin gene increased to 38.46%， while the resistance rate of isoniazid gene did not increase significantly for 6 years. Conclusion The resistant genotypes of rifampicin and isoniazid of Mycobacterium tuberculosis in Taizhou area is mainly the wild type，but the resistance rate of rifampicin gene is on the rise.
[Key words] Tuberculosis; Isoniazid; Rifampicin; Resistance gene
耐藥结核是全球公共卫生问题[1-4]。2018年全球新增利福平耐药结核病病例约50万[1];其中，我国是全球耐药结核病负担最大的三个国家之一。耐多药/利福平耐药结核病的确诊需要细菌学、痰培养、分子诊断、基因测序等手段[5]。结核病患者确诊后需要接受至少9～20个月的二线抗结核药物治疗[1]，更需要精准的用药指导。通过分子诊断技术检测结核分枝杆菌耐药基因，可快速准确判断耐药情况，提示临床医生根据耐药结果选用合适药物，不仅可以辅助临床选择最佳治疗方案，实行个体化医疗，也可以缩短疗程、降低医疗费用，从而减轻患者和社会的负担[6]。目前，尚无台州地区结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药基因流行病学的分析报道。恩泽医院是台州地区结核病定点医院，标本来源广泛，日常检测量大。
本研究对台州地区2015年8月至2020年11月送检到恩泽医院的经基因芯片菌种鉴定为结核分枝杆菌的482株临床菌株，采用DNA微阵列芯片法对利福平耐药、异烟肼耐药相关基因进行特异性检测，为台州地区耐药结核病基因型的流行趋势提供详细的研究数据，有利于临床抗结核病药物的合理使用。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1 菌株来源 2015年8月至2020年11月间连续在台州地区的三家医院（浙江省台州医院、台州恩泽医疗中心（集团）恩泽医院、路桥医院）收集的，并在台州恩泽医疗中心（集团）恩泽医院集中进行结核分枝杆菌耐药基因检测的菌株482例，已剔除其中重复送检且基因型相同的8例。
1.1.2 仪器和试剂 仪器包括微阵列芯片扫描仪（型号LuxScan-10K/B）、芯片杂交仪（型号BioMixer Ⅱ）、梯度PCR仪（型号T100THERMALCYCLER）、医用洗干仪（型号SlideWasherTM24）。结核分枝杆菌耐药基因芯片试剂盒购自博奥生物集团有限公司。
1.2方法
1.2.1 标本处理 标本经前处理后，先进行核酸提取与扩增，后进行杂交反应，最后洗涤芯片，具体操作步骤参照本单位前期已发表的文章[7]。
1.2.2扫描判读 运行结核分枝杆菌耐药基因检测芯片判别系统进行判读。
1.3观察指标
对所收集的标本进行利福平耐药相关基因rpoB的6個野生型和13个突变型、异烟肼耐药相关基因katG的1个野生型和2个突变型及inhA基因的启动子区的野生型和突变型特异性检测，分析其分布情况及趋势变化。
2结果
2.1结核分枝杆菌利福平、异烟肼耐药基因检出率分析
482例结核分枝杆菌耐药基因分析标本中，检测出结核分枝杆菌利福平基因rpoB野生型367例，占76.14%;突变型115例，占23.86%，其中突变型以rpoB531（C→T）突变为主，占11.41%。共检出异烟肼基因katG和inhA野生型372例，占77.18%;突变型110例，占22.82%，突变型中katG基因型katG315（G→C）突变和katG315（G→A）突变分别占18.88%、2.49%，inhA基因型inhA-15（C→T）突变占3.32%（表1）。此外，在482例患者中耐多药（至少对利福平和异烟肼同时耐药）结核分枝杆菌有75例，占15.56%;1例合并有草分枝杆菌感染，但是其结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药相关基因均为野生型。患者年龄中位数是55岁，最小13岁，最大92岁。性别以男性为主，占77.80%（375例）;女性占22.20%（107例）。
2.2 结核分枝杆菌利福平、异烟肼耐药基因的变化趋势
2015年8月至2020年11月间，利福平耐药基因检出率在2020年增加到38.46%，较前一年增加14.46%;异烟肼耐药基因检出率在此期间没有明显增长。
3 讨论
结核病是全球十大死亡原因之一，死亡率居单一传染病的首位[1-3]。全球约1/4的人口隐性感染结核分枝杆菌，有进一步发展为结核病的可能[1]。幸运的是，经过及时诊断和规范的抗结核治疗，大部分患者可以痊愈，减少了结核病的后续传播[1]。最新的耐多药/利福平耐药结核病治疗转归数据显示，全球治疗成功率达56%[1]。
现阶段，我国抗结核治疗使用的一线药物为利福平和异烟肼。由于抗生素使用不规范，造成部分抗结核药物的耐药性，以利福平和异烟肼的耐药率最高。2007年我国耐药基线调查数据显示，结核病耐药率达37.7%，其中耐多药率约为8.3%[8]。2010年全国结核病流行病学抽样调查报告显示，结核病耐多药率为6.8%，虽有所下降，但结核病负担仍然严峻[9]，这与崔怡然等[10]的报道一致。黄俊飞等[11]报道，2018年贵州省威宁县结核病的利福平耐药率是6.12%，耐多药率是2.04%;而仁怀市利福平耐药率是6.06%，耐多药率为6.06%[2]。郑芳等[12]报道2014-2017年衢州市2270株结核分枝杆菌总体耐多药率为5.51%。本研究结果显示利福平耐药率为23.86%，异烟肼耐药率为22.82%，高于以上报道的原因在于临床未对所有结核分枝杆菌标本做耐药基因检测。WHO报道2018年全球51%的细菌学确诊结核病例进行了利福平耐药检测，而在2017年只有41%[1]。其中，利福平耐药检测在新发结核病中占46%，在既往结核病中占83%[1]。据本单位的临床检测数据显示，只有28.30%的结核病患者进行了耐药基因检测，远远低于WHO推荐的细菌学确诊病例中耐药检测率的要求。因此，有必要在临床进一步推广结核病耐药基因检测项目。另外，本研究中有8例患者进行了多次耐药基因检测，未发现耐药性表型改变，表明现阶段临床治疗比较规范。
结核病的耐药基因分子诊断技术是基于耐药基因突变与药物表型之间的关联性，从而快速诊断耐药性的存在与否[6]。结核分枝杆菌基因分型研究是结核病分子流行病学监测和控制的基础，可鉴定流行病学相关分离株的型别，以确定传染源及发现新流行菌株，是研究主要流行株的基础[13-15]。杨慧娟等[16]报道云南省102株结核分枝杆菌中利福平耐药基因rpoB突变以rpoB531（C→T）突变为主，占29.41%;其次是rpoB526（C→G）突变，占12.75%。万勇敢等[17]报道河南省新乡地区174株结核分枝杆菌中利福平耐药基因以rpoB531（C→T）突变为主，占33.33%;其次是rpoB526（A→T）突变，占12.64%。本研究中结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB突变型也以rpoB531（C→T）突变为主，占11.41%;其次是rpoB526（C→G）突变，占3.32%，表明利福平耐药的流行株基因表型以rpoB531（C→T）突变为主。王兆芬等[18]报道青海地区196株结核分枝杆菌的异烟肼katG基因中katG315（G→C）突变和katG315（G→A）突变分别占28.06%和1.02%，inhA基因型inhA-15（C→T）突变占3.06%。周爱萍等[19]报道西安市117株异烟肼耐药的结核分枝杆菌中81株（69.23%）存在katG315位点突变，10株（8.55%）存在inhA-15位点突变。本研究中异烟肼耐药基因katG基因型katG315（G→C）突变和katG315（G→A）突变分别占18.88%和2.49%，inhA基因型inhA-15（C→T）突变占3.32%。菌株的突变模式依地理位置不同而变化，总体来说台州地区结核分枝杆菌的耐药率处于较低水平，但利福平基因耐药率呈上升趋势，需要持续监测其耐药水平变化。结核病的耐药监测是结核病防治的重要举措[20]，因此本研究还可作为地区级结核病监测的重要补充。
本文的局限性有：首先，这仍然是回顾性研究，菌株来源缺少合作单位外的结核分枝杆菌耐药检测标本。其次，本文只分析了结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药的相关基因，未与结核培养的药敏结果比较，存在临床表型不符合的可能。再次，本文只分析了结核分枝杆菌的耐药基因分布，未对其后续临床治疗效果进行评估，有待进一步的研究与证实。
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（收稿日期：2021-02-13）
