前言

一、软件安装

二、创建环境及安装软件

1.创建环境 chipseq

2.chipseq 环境下安装软件

三、具体分析步骤

1.数据来源

2.下载数据并重命名

3.fastq 文件转换（--sra-id 此步骤把 SRR 的名称改掉，加快运行速度，速度非常快）

4.质控

4.1 trim_galore

4.2 FastQC质控报告生成（旧的数据）

5.bowtie2比对(15min/file)

6.samtools sam 转换 bam

6.1view &sort

6.2 index

7.bamCoverage BW转换 bam 转换成 bw

8.IGV查看 bw文件 peak

9.MACS2 callpeak

10.MACS2 差异分析（2021-10-15 待完善）

11.Homer 分析 motif

11.1查看所有的 list:

11.2下载注释信息

11.3 Create a tag directory

11.4 Differentially Bound Peaks（找差异peak）

11.5 Annotate peaks（Peak注释）

用 R 把差异peak 和 Peak 注释合并：fread,merge 函数

11.6 其他功能

12. ROSE 寻找超级增强子 SE（super enhancer）

12.1 参考教程： ROSE | 超级增强子鉴定

12.2 ROSE 安装见上

12.3 ROSE 寻找 SE

前言
自己做笔记自己看的

一、软件安装

设备：mac m1 电脑

软件程序安装
参考教程Macbook Pro M1芯片Python开发环境配置_朝歌晚酒南栀雪的博客-CSDN博客
- xcode
- item2
- git
- homebrew
```
brew install wget #安装 wget
```
- anaconda-pkg

Anaconda | Individual Edition 下载链接

Installing on macOS — Anaconda documentation 帮助链接

pycharm CE

二、创建环境及安装软件

1.创建环境 chipseq

conda  create -n chipseq  python=3
	conda activate chipseq #激活环境
	conda deactivate

2.chipseq 环境下安装软件

ps:一项一项安装，不然容易卡住

conda install -y bioconda parallel-fastq-dump  #SRR→FASTQ 转换

conda install -y trim-galore #质控

conda install -y bioconda bowtie2 # fastq比对到 hg19

brew tap homebrew/science 

brew install samtools #sam 转化为 bam

conda install -y macs2 #峰值定量，差异分析

conda install -y conda-forge libgfortran #macs2 差异分析辅助用

conda install -y bioconda deeptools #可视化
   #包含 bamcoverage
    https://deeptools.readthedocs.io/en/latest/content/tools/bamCoverage.html

IGV 下载https://software.broadinstitute.org/software/igv/download #可视化

ROSE 安装

https://bitbucket.org/young_computation/rose/src/master/ ROSE 下载
#把所有要处理的文件都放到 rose 文件夹：sorted.bam, bed,bam.bai
#创建 Python2.7
	conda  create -n rose  python=2.7
	conda activate rose

Homer安装

公众号参考 HOMER | chipseq数据进行peaks的差异分析
homer安装： chipseq 环境下，conda install -c bioconda homer
- 下载configureHomer.pl http://homer.ucsd.edu/homer/configureHomer.pl
- 文件放在想要安装 homer 的文件夹中，/Users/xusiqi/chip/homer
  - 目录文件夹中安装 homer :

perl configureHomer.pl -install

open -a TextEdit ~/.bash_profile

PATH=$PATH:/Users/chucknorris/homer/bin/  #路径加入到系统路径中

source ~/.bash_profile

perl configureHomer.pl -list #查看所有的 list

三、具体分析步骤

1.数据来源
使用数据Wang J, Zou JX, Xue X, Cai D et al. ROR-γ drives androgen receptor expression and represents a therapeutic target in castration-resistant prostate cancer. Nat Med 2016 May;22(5):488-96. PMID: 27019329

GSM1868876: C4-2B vehicle Input chip seq; Homo sapiens; ChIP-Seq(SRR2242690)

https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?run=SRR2242690

GSM1868866: C4-2B vehicle AR chip seq; Homo sapiens; ChIP-Seq(SRR2242680)

https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?run=SRR2242680

GSM1868862: 2nd time C4-2B vehicle AR chip seq; Homo sapiens; ChIP-Seq(SRR2242676)

https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?run=SRR2242676

GSM1868864: 2nd time C4-2B vehicle Input chip seq; Homo sapiens; ChIP-Seq(SRR2242678)

https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?run=SRR2242678

2.下载数据并重命名

wget https://sra-pub-run-odp.s3.amazonaws.com/sra/SRR8557353/SRR8557353
mv     SRR8557353      input.h3k.con
 
wget https://sra-downloadb.be-md.ncbi.nlm.nih.gov/sos3/sra-pub-run-20/SRR8557351/SRR8557351.1
mv  SRR8557351.1   ip.h3k.con
 
wget https://sra-downloadb.be-md.ncbi.nlm.nih.gov/sos3/sra-pub-run-21/SRR8557354/SRR8557354.1
mv  SRR8557354.1   input.h3k.xy
 
wget https://sra-pub-run-odp.s3.amazonaws.com/sra/SRR8557352/SRR8557352
mv   SRR8557352     ip.h3k.xy

3.fastq 文件转换（--sra-id 此步骤把 SRR 的名称改掉，加快运行速度，速度非常快）

parallel-fastq-dump —sra-id input.h3k.con —threads 35  —outdir out/ —split-files —gzip
parallel-fastq-dump —sra-id ip.h3k.con   —threads 35  —outdir out/ —split-files —gzip
parallel-fastq-dump —sra-id  input.h3k.xy   —threads 35  —outdir out/ —split-files —gzip
parallel-fastq-dump —sra-id   ip.h3k.xy   —threads 35  —outdir out/ —split-files —gzip

4.质控

4.1 trim_galore

trim_galore（只能单线程）
- Cutadapt:去接头，去除3端低质量碱基，去除长度太短的序列
  - report.txt
  - fq.gz(用来比对)

trim_galore input.h3k.con_1.fastq.gz  -q 25 —phred33 —length 25 -e 0.1 —stringency 4 
trim_galore input.h3k.xy_1.fastq.gz  -q 25 —phred33 —length 25 -e 0.1 —stringency 4 
trim_galore ip.h3k.con_1.fastq.gz  -q 25 —phred33 —length 25 -e 0.1 —stringency 4 
trim_galore ip.h3k.xy_1.fastq.gz  -q 25 —phred33 —length 25 -e 0.1 —stringency 4

4.2 FastQC质控报告生成（旧的数据）

fastqc -o /Users/xusiqi/CHIP/out -t 6 /Users/xusiqi/CHIP/out/SRR2242680_1_trimmed.fq.gz
fastqc -o /Users/xusiqi/CHIP/out -t 6 /Users/xusiqi/CHIP/out/SRR2242690_1_trimmed.fq.gz
fastqc -o 输出绝对路径 -t 线程数输入文件绝对路径
-o 后面为文件输出绝对路径，-t 6(为线程数)，最后为输入文件绝对路径；大约 5min/file

5.bowtie2比对(15min/file)

bowtie2 -p 35 -x /Users/xusiqi/CHIP/index/hg19/hg19 -U  /Users/xusiqi/CHIP/lesson23/out/input.h3k.con_1_trimmed.fq.gz  -S input.h3k.con.sam
bowtie2 -p 35 -x /Users/xusiqi/CHIP/index/hg19/hg19 -U  /Users/xusiqi/CHIP/lesson23/out/input.h3k.xy_1_trimmed.fq.gz  -S input.h3k.xy.sam
bowtie2 -p 35 -x /Users/xusiqi/CHIP/index/hg19/hg19 -U  /Users/xusiqi/CHIP/lesson23/out/ip.h3k.con_1_trimmed.fq.gz  -S ip.h3k.con.sam
bowtie2 -p 35 -x /Users/xusiqi/CHIP/index/hg19/hg19 -U  /Users/xusiqi/CHIP/lesson23/out/ip.h3k.xy_1_trimmed.fq.gz  -S ip.h3k.xy.sam

6.samtools sam 转换 bam

6.1view &sort

samtools view -S -b input.h3k.con.sam > input.h3k.con.bam
samtools sort input.h3k.con.bam -o input.h3k.con.sorted.bam
 
samtools view -S -b input.h3k.xy.sam > input.h3k.xy.bam
samtools sort input.h3k.xy.bam -o input.h3k.xy.sorted.bam
 
samtools view -S -b ip.h3k.con.sam >ip.h3k.con.bam
samtools sort ip.h3k.con.bam -o ip.h3k.con.sorted.bam
 
samtools view -S -b ip.h3k.xy.sam > ip.h3k.xy.bam
samtools sort ip.h3k.xy.bam -o ip.h3k.xy.sorted.bam

6.2 index

samtools index input.h3k.con.sorted.bam
samtools index input.h3k.xy.sorted.bam
samtools index ip.h3k.con.sorted.bam
samtools index  ip.h3k.xy.sorted.bam

7.bamCoverage BW转换 bam 转换成 bw

bamCoverage -e 170 -bs 10 -p 35 -b input.h3k.con.sorted.bam -o input.h3k.con.sorted.bw
bamCoverage -e 170 -bs 10 -p 35 -b input.h3k.xy.sorted.bam -o input.h3k.xy.sorted.bw
bamCoverage -e 170 -bs 10 -p 35 -b ip.h3k.con.sorted.bam -o ip.h3k.con.sorted.bw
bamCoverage -e 170 -bs 10 -p 35 -b ip.h3k.xy.sorted.bam -o ip.h3k.xy.sorted.bw

8.IGV查看 bw文件 peak
IGV 下载 Downloads | Integrative Genomics Viewer
IGV 打开 bw 文件

9.MACS2 callpeak

macs2 callpeak -t 实验 sorted.bam -c 对照inputsorted.bam -g hs -B -f BAM -n 输出名称（无后缀，简单命名） -q 0.05

macs2 callpeak -t ip.h3k.con.sorted.bam -c   input.h3k.con.sorted.bam -g hs -B -f BAM -n con  -q 0.05
macs2 callpeak -t ip.h3k.xy.sorted.bam -c   input.h3k.xy.sorted.bam -g hs -B -f BAM -n xy -q 0.05

10.MACS2 差异分析（2021-10-15 待完善）
参考教程：

Call differential binding events · macs3-project/MACS Wiki · GitHub

需要的文件名

input.h3k.con.sorted.bam
input.h3k.xy.sorted.bam
ip.h3k.con.sorted.bam
ip.h3k.xy.sorted.bam

con_control_lambda.bdg

xy_control_lambda.bdg

con_treat_pileup.bdg

xy_treat_pileup.bdg

d-length

tags after filtering

macs2 predictd -i input.h3k.con.sorted.bam

macs2 predictd -i input.h3k.xy.sorted.bam

macs2 predictd -i ip.h3k.con.sorted.bam

macs2 predictd -i  ip.h3k.xy.sorted.bam

199

205

13313222

24184450

22342330

21410271

202

callpeak excle 表中就有

11.Homer 分析 motif
公众号参考 HOMER | chipseq数据进行peaks的差异分析

11.1查看所有的 list:

perl configureHomer.pl -list

11.2下载注释信息

perl configureHomer.pl -install hg19   
#（安装hg19的GENOMES,会自动下载human数据，1.38G，多试几次，网速可达 6-7Mb)

11.3 Create a tag directory

homer 下新建一个 out 文件夹，在此路径下运行以下代码

makeTagDirectory 文件夹名（tag directory） -genome hg19(带绝对路径) -checkGC 输入文件 sam（绝对路径）

输入文件名：input.h3k.con.sam input.h3k.xy.sam ip.h3k.con.sam ip.h3k.xy.sam

makeTagDirectory  input.h3k.con  -genome /Users/xusiqi/chip/homer/data/genomes/hg19 -checkGC /Users/xusiqi/chip/lesson23/out/input.h3k.con.sam
makeTagDirectory input.h3k.xy  -genome /Users/xusiqi/chip/homer/data/genomes/hg19 -checkGC /Users/xusiqi/chip/lesson23/out/input.h3k.xy.sam
makeTagDirectory  ip.h3k.con  -genome /Users/xusiqi/chip/homer/data/genomes/hg19 -checkGC /Users/xusiqi/chip/lesson23/out/ip.h3k.con.sam
makeTagDirectory  ip.h3k.xy  -genome /Users/xusiqi/chip/homer/data/genomes/hg19 -checkGC /Users/xusiqi/chip/lesson23/out/ip.h3k.xy.sam

11.4 Differentially Bound Peaks（找差异peak）

getDifferentialPeaks [options]

输入文件名：

con_peaks.narrowPeak xy_peaks.narrowPeak
input.h3k.con input.h3k.xy ip.h3k.con ip.h3k.xy

getDifferentialPeaks /Users/xusiqi/chip/lesson23/out/con_peaks.narrowPeak ip.h3k.con/ input.h3k.con/ > con.diffpeaks.csv
getDifferentialPeaks /Users/xusiqi/chip/lesson23/out/xy_peaks.narrowPeak ip.h3k.xy/ input.h3k.xy/ > xy.diffpeaks.csv

11.5 Annotate peaks（Peak注释）

Usage: annotatePeaks.pl [additional options...]

输入文件名：con.diffpeaks.csv xy.diffpeaks.csv

annotatePeaks.pl con.diffpeaks.csv /Users/xusiqi/chip/homer/data/genomes/hg19 > con.diffpeaks.anno.txt
annotatePeaks.pl xy.diffpeaks.csv /Users/xusiqi/chip/homer/data/genomes/hg19 > xy.diffpeaks.anno.txt

用 R 把差异peak 和 Peak 注释合并：fread,merge 函数

11.6 其他功能
annotatePeaks.pl程序还可以用于创建显示相对于给定基因组特征(包括转录起始位点(TSS)或用户想要定义的任何其他区域)的相对读富集的直方图。由于TSS经常用于此目的，所以HOMER为TSS提供了一个内置注释(基于RefSeq转录本)。创建直方图的关键参数是“-hist #”和“-size #”选项，它们控制直方图的装箱大小和总长度。另一个重要的选项是“-d”，它指定要为哪些实验编译直方图。
annotatePeaks.pl tss hg19 -size 8000 -hist 10 -d h3k.con/ h3k.bay/ > output.txt
用电子表格程序/Excel打开output.txt文件。将注意到第一列给出了到TSS的距离偏移量，然后是对应于每个实验的“覆盖率”、“+标记”和“-标记”的列。尝试用第一列作为X-Y线形图来查看模式。

12. ROSE 寻找超级增强子 SE（super enhancer）

12.1 参考教程： ROSE | 超级增强子鉴定

12.2 ROSE 安装见上

12.3 ROSE 寻找 SE

 
python ROSE_main.py -g HG19 -i xy_summits.bed -r ip.h3k.xy.sorted.bam -c input.h3k.xy.sorted.bam -o /Users/xusiqi/chip/rose/xy
python ROSE_main.py -g HG19 -i con_summits.bed -r ip.h3k.con.sorted.bam -c input.h3k.con.sorted.bam -o /Users/xusiqi/chip/rose/con

（未完待续）

Chip-seq分析笔记

前言
自己做笔记自己看的

二、创建环境及安装软件

1.创建环境 chipseq
conda create -n chipseq python=3 conda activate chipseq #激活环境 conda deactivate

三、具体分析步骤

4.质控

6.samtools sam 转换 bam

6.2 index
samtools index input.h3k.con.sorted.bam samtools index input.h3k.xy.sorted.bam samtools index ip.h3k.con.sorted.bam samtools index ip.h3k.xy.sorted.bam

8.IGV查看 bw文件 peak
IGV 下载 Downloads | Integrative Genomics Viewer
IGV 打开 bw 文件

11.Homer 分析 motif
公众号参考 HOMER | chipseq数据进行peaks的差异分析

11.1查看所有的 list:
perl configureHomer.pl -list

11.2下载注释信息
perl configureHomer.pl -install hg19 #（安装hg19的GENOMES,会自动下载human数据，1.38G，多试几次，网速可达 6-7Mb)

用 R 把差异peak 和 Peak 注释合并：fread,merge 函数

12. ROSE 寻找超级增强子 SE（super enhancer）

12.1 参考教程： ROSE | 超级增强子鉴定

12.2 ROSE 安装见上

12.3 ROSE 寻找 SE
python ROSE_main.py -g HG19 -i xy_summits.bed -r ip.h3k.xy.sorted.bam -c input.h3k.xy.sorted.bam -o /Users/xusiqi/chip/rose/xy python ROSE_main.py -g HG19 -i con_summits.bed -r ip.h3k.con.sorted.bam -c input.h3k.con.sorted.bam -o /Users/xusiqi/chip/rose/con

（未完待续）

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二、创建环境及安装软件

1.创建环境 chipseq conda create -n chipseq python=3 conda activate chipseq #激活环境 conda deactivate

三、具体分析步骤

4.质控

6.samtools sam 转换 bam

6.2 index samtools index input.h3k.con.sorted.bam samtools index input.h3k.xy.sorted.bam samtools index ip.h3k.con.sorted.bam samtools index ip.h3k.xy.sorted.bam

8.IGV查看 bw文件 peak IGV 下载 Downloads | Integrative Genomics Viewer IGV 打开 bw 文件

11.Homer 分析 motif 公众号参考 HOMER | chipseq数据进行peaks的差异分析

11.1查看所有的 list: perl configureHomer.pl -list

11.2下载注释信息 perl configureHomer.pl -install hg19 #（安装hg19的GENOMES,会自动下载human数据，1.38G，多试几次，网速可达 6-7Mb)

用 R 把差异peak 和 Peak 注释合并：fread,merge 函数

12. ROSE 寻找超级增强子 SE（super enhancer）

12.1 参考教程： ROSE | 超级增强子鉴定

12.2 ROSE 安装见上

12.3 ROSE 寻找 SE python ROSE_main.py -g HG19 -i xy_summits.bed -r ip.h3k.xy.sorted.bam -c input.h3k.xy.sorted.bam -o /Users/xusiqi/chip/rose/xy python ROSE_main.py -g HG19 -i con_summits.bed -r ip.h3k.con.sorted.bam -c input.h3k.con.sorted.bam -o /Users/xusiqi/chip/rose/con （未完待续）

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conda create -n chipseq python=3 conda activate chipseq #激活环境 conda deactivate

6.2 index
samtools index input.h3k.con.sorted.bam samtools index input.h3k.xy.sorted.bam samtools index ip.h3k.con.sorted.bam samtools index ip.h3k.xy.sorted.bam

8.IGV查看 bw文件 peak
IGV 下载 Downloads | Integrative Genomics Viewer
IGV 打开 bw 文件

11.Homer 分析 motif
公众号参考 HOMER | chipseq数据进行peaks的差异分析

11.1查看所有的 list:
perl configureHomer.pl -list

11.2下载注释信息
perl configureHomer.pl -install hg19 #（安装hg19的GENOMES,会自动下载human数据，1.38G，多试几次，网速可达 6-7Mb)

12.3 ROSE 寻找 SE
python ROSE_main.py -g HG19 -i xy_summits.bed -r ip.h3k.xy.sorted.bam -c input.h3k.xy.sorted.bam -o /Users/xusiqi/chip/rose/xy python ROSE_main.py -g HG19 -i con_summits.bed -r ip.h3k.con.sorted.bam -c input.h3k.con.sorted.bam -o /Users/xusiqi/chip/rose/con

（未完待续）