周盛会+汤浩
摘要：本文通过检索PubMed（美国国家医学图书馆信息检索系统）、中国知识资源总库（CNKI）、中国生物医学文献数据库（CBM）及中国学术期刊数据库（万方数据）等中外文数据库十几年来有关中药调节药物代谢细胞色素P450酶（CYP450）的期刊文献，主要从CYP450体内体外研究方法方面进行归纳、整理和分析，为今后中药调节CYP450酶研究提供参考。
关键词：细胞色素P450；检测方法；中药；综述
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.11.035
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）11-0131-06
Abstract： Through searching literature about cytochrome P450 from PubMed， CNKI， CBM and Wanfang database in the recent 10 years， this article concluded， summarized and analyzed vivo and vitro research methods of cytochrome P450 to provide references for the study on TCM cytochrome P450 enzyme.
Key words： cytochrome P450； methodology； TCM； review
随着临床应用和研究的不断深入，中药有关的不良反应逐渐受到重视。有临床证据显示，中药与西药合用后可能发生药物之间的相互作用，包括不良反应，如银杏与华法令合用后有加重出血的倾向[1]、贯叶连翘与茚地那韦合用降低疗效[2]等。中药与临床药物联合使用时，因药物代谢而产生的相互作用发生率最高，与药物体内代谢关系最大的酶是细胞色素P450（CYP450）。该酶系可被多种药物诱导或抑制，且有显著个体差异。因此，鉴定更多由CYP450催化代谢的药物，研究其基因表达与调控的分子机制，阐明酶个体差异和种族差异的机理，能够为临床合理用药提供实验依据，做到用药剂量个体化，提高疗效，减少不良反应。兹从中药成分的CYP450研究方法方面综述近年来国内外所报道的研究成果，为中药有效成分对CYP450同工酶活性影响研究提供参考。
1 细胞色素P450概述
CYP450又称肝药酶，在哺乳动物中，主要分布于肝脏，在肺、皮肤、肠道也有少量表达。CYP450因其蛋白质种类的多样性及其底物的重叠性，使CYP450酶系可以催化多种类型的反应，不仅对许多外来物质如农药及其他环境有毒物质具有代谢作用，还参与一些具有重要生理功能的内源性物质如激素、脂肪酸等的代谢，在生物体中起十分重要的作用。
与临床药物代谢密切相关，常检测的CYP450酶亚型有CYP1A2、2A6、2C、2D6、2E1和3A4，分别约占总P450酶代谢药物的比例为4%、2%、12%、20%、2%和55%，占肝脏总CYP450含量的比例分别为13%、4%、20%、4%、7%和30%。
2 细胞色素P450的研究方法
2.1 体内研究
近年来，随着现代色谱技术如高效液相色谱法（HPLC）、液相-质谱联用法（LC-MS/MS）及超高效液相色谱法（UPLC）的迅猛发展，“鸡尾酒”（Cocktail）探针药物法已取代了传统探针药物法用于CYP450酶活性的测定。“Cocktail”探针药物法通过同时使用2种及以上特定探针底物而描述药代动力学特征性变化的实验，以研究药物对CYP450酶亚型活性的诱导或抑制作用，该法可同时检测多种药物代谢酶的活性，将个体差异的影响降至最低，还可在单个实验过程获得多个代谢途径的信息，能真实客观反映药物在体内的代谢特征，但不足之处在于CYP450同工酶具有底物交叉性。“Cocktail”探针药物法结合了现代色谱技术，大大提高了多组分复杂样本中物质检出的有效性、准确性及检测速率，已成为研究CYP450最主要、最常用的体内方法。
2.1.1 动物体内研究 目前主要采用Wistar和SD两种品系大鼠进行CYP450酶活性的研究。王氏等[3]建立SD大鼠血浆中非那西丁与其代谢物对乙酰氨基酚含量的HPLC测定而确证甘草水提液对CYP1A2有明显诱导作用；Xiao等[4]分别用双氯芬酸、咪达唑仑、右美沙芬、氯唑沙宗和奥美拉唑作为探针药物，结合LC-MS研究胡黄连苷对CYP2C9、3A4、2D6、2E1和2C19的影响；Hu等[5]用“Cocktail”探针药物法结合HPLC测定黄芩对4种主要CYP450酶活性的影响，显示黄芩对CYP1A2存在抑制作用，降低其活性，可能会导致经此酶代谢的其他药物代谢减慢，血药浓度升高，作用时间延长。由于种属差异的广泛存在，直接将动物体内实验数据外推至人体内药物相互作用有时并不准确，因此，动物体内实验只可用于初步预测药物间相互作用。
2.1.2 人体内研究 由于CYP450酶的多态性，药物作用广泛存在种属和个体差异，所以，在动物体内研究基础上，应在人体内进行药物对CYP450活性的研究。肖氏等[6]采用“Cocktail”探针药物法结合LC-MS/MS，以咪达唑仑作为探针底物，测定金雀异黄酮在人体内对CYP3A活性的影响，结果金雀异黄酮对体内CYP3A酶活性具有显著诱导作用，并建议临床使用时应注意经CYP3A代谢的药物与金雀异黄酮合用时可能发生的潜在相互作用。Stewart等[7]采用UPLC-MS/MS与“Cocktail”法联用测定人血浆和尿中6种CYP450的探针药物和代谢产物浓度，用于评估CYP450表型特征。但该法因受试者的限制而难以广泛开展。
2.2 体外研究
体外实验的优点是适合所有由CYP450代谢的化学物质的代谢研究，排除其他因素干扰，直接观察酶对底物的选择代谢性，为体内实验提供可靠的依据。近年来，体外实验的研究方法主要有肝微粒体孵育法、肝细胞培养法、肝脏组织切片法、原位肝脏灌流法、基因重组P450酶系及微透析法等，各体外实验方法优缺点对比见表1。
2.2.1 肝微粒体孵育法 微粒体是指在细胞匀浆和差速离心过程中获得的由破碎内质网自我融合形成近似球形的膜囊泡状结构，直径大约100 nm，是异质性的集合体。肝（或其他组织）微粒体体外温孵实验是采用从肝脏（或其他组织）提取的微粒体，加入还原型辅酶Ⅱ（NADPH）再生系统，在体外模拟生理环境进行代谢反应，采用HPLC、HPLC-MS等测定方法对原型药及代谢产物进行测定的一种体外代谢实验方法。有研究将人肝微粒体、各CYP450同工酶底物（2A6-香豆素、2C9-双氯芬酸、3A4-睾酮）及不同浓度的花青素加入NADPH再生系统共同孵育，采用HPLC测定各同工酶底物相应的羟基代谢产物，通过计算Vmax和KM值确定酶的活性，结果显示花青素可抑制CYP2A6、2C9、3A4活性[8]。基于以上特点，肝微粒体孵育法广泛应用于体外药物代谢转化研究中。见表2。
2.2.2 肝细胞培养法 肝细胞培养法主要提供细胞水平上吸收、分布、代谢和排泄的综合信息，为代谢性药物相互作用、临床合理用药、毒理学等方面提供有效的分析手段和理想的体外模型。常用的肝细胞模型有原代肝细胞培养、肝癌细胞培养及Chang Liver细胞培养。见表3。
2.2.2.1 原代肝细胞培养法 原代肝细胞能够为药物代谢研究提供最接近体内情况的体外环境，但因肝细胞来源少、标本的异源性、培养条件的异源性等原因，限制了其应用。Dumrongsak等[10]采用两步胶原酶灌注法制得人和大鼠肝细胞进行培养，将培养的肝细胞与穿心莲内酯共同培养3 d，提取肝细胞中蛋白和RNA，结合分子生物学方法检测穿心莲内酯对人和大鼠肝细胞中蛋白及mRNA影响，结果显示穿心莲内酯显著降低CYP2C9和3A4蛋白及mRNA表达（P<0.05），说明穿心莲内酯通过调节2C9和3A4 mRNA的表达发生药物-药物间相互作用。随着原代肝细胞培养技术水平的不断提高，该技术已广泛用于有关P450酶方面的研究。
2.2.2.2 肝癌细胞培养法 HepG2、Hep 3b等细胞株由于是肿瘤来源细胞，生物学形态发生了显著改变，繁殖速度加快，易于培养，故常用肝癌细胞株代替原代肝细胞作为体外诱导模型，结合分子生物学技术如PCR、Western blot和免疫组化检测CYP450 mRNA及蛋白的表达。有学者培养HepG2细胞研究丹参酮对CYP1A2活性的影响，通过RT-PCR和Western blot检测其mRNA和蛋白表达，mRNA和蛋白水平均上调，表明丹参酮对CYP1A2有诱导作用[37]。
2.2.2.3 Chang Liver细胞培养法 Chang Liver，即人张氏肝细胞，1954年从非恶性瘤的人体组织中建立，广泛用于病毒学、生化和恶性肿瘤相关的转移研究，该细胞上皮细胞样，贴壁生长，对人体细胞内环境与人体内环境的符合程度介于原代肝细胞与肿瘤细胞之间，培养方便，条件稳定。袁氏等[26]研究银杏叶提取物及其黄酮类单体成分对Chang Liver细胞中CYP3A4和CYP2C9活性影响，发现银杏叶提取物和槲皮素诱导Chang Liver细胞中CYP3A4 mRNA及蛋白的表达，槲皮素抑制了该细胞中CYP2C9 mRNA和蛋白表达，而银杏叶提取物对CYP2C9 mRNA和蛋白表达没有影响。这些结果为银杏叶提取物与其他药物相互作用提供了理论基础，有助于提高联合用药的有效性和安全性。
2.2.3 肝脏切片法 肝脏切片作为体外模型应用于中药有效成分对CYP450诱导作用的研究已有多年。有学者采用组织切片机将琼脂糖包埋的肝脏样本切成厚度一致（直径为8 mm）切片进行培养，结合分子生物学方法从mRNA角度探究β-萘黄酮对CYP1A2、2B1、3A1 mRNA的诱导作用，结果β-萘黄酮显著诱导CYP1A2、2B1的mRNA表达[28]。该法将对细胞的创伤降至最低，但对药物的摄取及代谢率也较低，且需长期培养，因而限制其作为筛选药物模型的应用，如能克服这些缺点，将会得到更广泛的应用。
2.2.4 原位肝脏灌流法 原位肝脏灌流是模拟体内药物代谢的一种有效模型，在动物躯体内、肝脏的原位上进行插管手术及灌注，适用于药动学、代谢性药物相互作用、肝提取率、首过效应、药物对肝脏的作用等多方面的研究。Dostalek等[29]将大鼠麻醉后在门静脉插入玻璃套管，预灌注20 min后加入含有相应底物（CYP2C9-甲苯磺丁脲、CYP3A4-咪达唑仑、CYP2D6-右美沙芬）的灌流液，以25 mL/min流速分别在30、60、120 mim取灌流液，结合HPLC检测底物代谢物的产量，从恒定的灌流压和灌流速率、灌流液的pH值、耗氧量、肝重及肉眼观察等方面监测肝活性。由于该方法对代谢研究的范围仅限于肝脏，无法避免受肝门静脉和动脉血流、神经和激素等内源性物质对肝脏代谢的影响，相对于肝微粒体孵育法和肝细胞培养法，较少用于肝药酶代谢的研究。
2.2.5 重组人细胞色素P450酶法 体外重组技术是近年发展起来的一项实验技术，随着分子生物学和重组技术的快速发展，CYP450的体外重组研究也取得了较快进展。该法需要建立大量模拟人体的CYP450亚型重组蛋白，通过一些结构修饰来真正模拟人体代谢过程，例如修饰后在大肠杆菌表达的CYP450蛋白酶，能很好用于结构分析。Li等[15]为探究参与黄连素一相代谢的主要CYP450亚型酶，利用重组人CYP450酶，选取野生型棒状杆菌的昆虫细胞作为表达系统进行黄连素代谢物结构分析，结果显示，CYP2D6、CYP1A2、CYP3A4是将黄连素转化成代谢物唐松草分定和去亚甲基小檗碱的主要亚型酶。目前该法常用于结构研究所需要的CYP450表达系统有大肠杆菌和昆虫细胞[30]。
2.2.6 微透析法 微透析法是一种在生物活体内进行微量化学采样与检测的方法，可按一定时间间隔连续收集透析液，不经预处理便可直接检测透析液中待测生物活性物质水平。Chang等[31]为研究水飞蓟素和曲唑酮联合用药可能发生的相互作用，采用微透析技术结合HPLC，利用PE管给SD大鼠股静脉插管给予曲唑酮，监测血浆中曲唑酮浓度。结果显示，水飞蓟素在正常剂量下对曲唑酮的药动学参数无显著影响，提示其与曲唑酮合用相对安全。
3 展望
临床上常发生由CYP450酶活性变化引起的药物不良反应，P450酶系被诱导或抑制，导致药物本身或联用药物疗效降低或毒性增加，影响了药物的治疗作用。
在体动物实验能够真实客观反映药物在体内的代谢特征，但因种属和个体差异的存在，体内实验数据无法完全反映药物在人体内的代谢情况及药物相互作用，因此，建立体外预测方法也十分有必要。
体外实验排除了其他因素的干扰，能够直接观察药物对酶活性的影响，可为进一步设计在体实验提供指导。但因体内体外相关性不强，体外实验数据预测体内药物相互作用依然面临挑战。所以，体内与体外实验结合研究药物对CYP450酶活性的影响，预测药物之间相互作用，指导临床合理用药，具有十分重要的意义。
在上述体内体外实验方法的基础上优化建立新方法十分重要。近年来也研制出了硅片模型[38]、干细胞模型[39]等新的检测方法，待其完善成熟之后，将有力推动中药在药物代谢方面的研究。
参考文献：
[1] EMST E. Possible interactions between synthetic and herbal medicinal products. Part 1：a systematic review of indirect evidence[J]. Perfusion，2000，13：4-15.
[2] PISCITELLI S C， BURSTEIN A H， CHAITT D， et al. Indinavir concentrations and St John's wort[J]. Lancet，2000， 355：547-549.
[3] 王新敏，彭蕴茹，景欣悦，等.HPLC法测定大鼠血浆、微粒体中非那西丁与其代谢物含量及其应用[J].中国药理学通报，2013，29（4）：591-592.
[4] XIAO Y J， JIANG Z Z， YAO J C， et al. Investigation of picroside's impacts on the P450 activities using a cocktail method[J]. Chin J Nat Med，2008，6（4）：292-297.
[5] HU Z S， WANG Z， ZHANG Y， et al. Simultaneous evaluation of the influence of Scutellaria baicalensis Georgi on CYP450 by Cocktail probe drugs[J]. Chin Hosp Pharm J，2010，30（2）：108-110.
[6] 肖昌琼，周宏灏.金雀异黄酮在体内对CYP3A活性的影响[J].中国临床药理学治疗学，2011，16（6）：643-646.
[7] STEWART N A， BUCH S C， ConRADS T P， et al. A UPLC-MS/MS assay of the “cocktail”：six CYP probe-drug/metabolites from human plasma and urine using stable isotope dilution[J]. Analyst，2011， 136（3）：605-612.
[8] SROVNALOVA A， SVECAROVA M， MICHAELA K Z， et al. Effects of anthocyanidins and anthocyanins on the expression and catalytic activities of CYP2A6， CYP2B6， CYP2C9， and CYP3A4 in primary human hepatocytes and human liver microsomes[J]. Journal of Agriculiural and Food Chemistry，2014，62：789-797.
[9] GUO X Y， LIU Y， LIN Z P， et al. Effects of Eleutheroside B and Eleutheroside E on activity of cytochrome P450 in rat liver microsomes[J]. BMC Complementary & Alternative Medicine，2014，14：1-7.
[10] DUMRonGSAK P， NADEGE B， CATHERINE A， et al. Effects of Andrographis paniculata extract and Andrographolide on hepatic cytochrome P450 mRNA expression and monooxygenase activities after in vivo administration to rats and in vitro in rat and human hepatocyte cultures[J]. Chemico-Biological Interactions，2009， 179：247-255.
[11] TIAN X， CHENG Z Y， HE J， et al. Concentration-dependent inhibitory effects of baicalin on the metabolism of dextromethorphan， a dual probe of CYP2D and CYP3A， in rats[J]. Chemico-Biological Interactions，2013，203：522-529.
[12] YATING D， WANG L， YANG Y， et al. In vitro inhibition and induction of human liver cytochrome P450 enzymes by gentiopicroside：potent Effect on CYP2A6[J]. Drug metab Pharmacokinet，2013，28（4）：339-344.
[13] JEONG H U， KONG T Y， KWON S S， et al. Effect of honokiol on cytochrome P450 and UDP-glucuronosyltransferase enzyme activities in human liver microsomes[J]. Molecules，2013，18：10681-10693.
[14] LI X， WANG K， WEI W， et al. In vitro metabolism of brucine by huamn liver microsomes and its interactions with CYP substrates[J]. Chemico-Biological Interactions，2013，204：140- 143.
[15] LI Y， REN G， WANG Y X， et al. Bioactivities of berberine metabolites after transformation through CYP450 isoenzymes[J]. Journal of Translational Medicine，2011，9：62-72.
[16] SI D Y， WANG Y， ZHOU Y H， et al. Mechanism of CYP2C9 inhibition by flavones and flavonols[J]. Drug metabolism and Disposition， 2009，37（3）：629-634.
[17] LI L， JUAN X， HONG P Z， et al. In vitro metabolism of glycyrrhetic acid by human cytochome P450[J]. Acta Pharmaceutica Sinica，2011，46（1）：81-87.
[18] DOEHMER J， GABRIELE W， GERARD P M， et al. Assessment of a dry extract from milk thistle （Silybum marianum） for interference with human liver cytochrome-P450 activities[J]. Toxicology in Vitro，2011，25：21-27.
[19] JARUCHOTIKAMOL A， JARUKAMJORN K， SIRISANGTRAKUL W， et al. Strong synergistic induction of CYP1A1 expression by andrographolide plus typical CYP1A inducers in mouse hepatocytes[J]. Toxicology and Applied Pharmacology，2007，224：156-162.
[20] MARTIN K R， CHRISTINA L K， BO E. Regulation of cytochrome P450 mRNA expression in primary porcine hepatocytes by selected secondary plant metabolites from chicory （Cichorium intybus L.）[J]. Food Chemistry，2014，146：255-263.
[21] HAO M， BA Q， YIN J， et al. Deglycosylated ginsenosides are more potent inducers of CYP1A1， CYP1A2 and CYP3A4 expression in HepG2 cells than glycosylated ginsenosides[J]. Drug metab Pharmacokinet，2011，26（2）：201-205.
[22] ROCEJANASAROJ A， TENCOMNAO T， SANGKITIKOMOL W. Thunbergia laurifolia extract minimizes the adverse effects of toxicants by regulating P-glycoprotein activity， CYP450， and lipid metabolism gene expression in HepG2 cells[J]. Genetics and Molecular Research，2014，13（1）：205-219.
[23] 汤浩，高庆剑，陆铖，等.阿魏酸和异阿魏酸对HepG2细胞增殖及其细胞色素P450酶的影响[J].中草药，2014，45（12）：1726-1730.
[24] 周涛，王宇光，马增春.银杏内酯B通过激活孕烷X受体诱导CYP3A4的表达[J].中国药理学通报，2014，30（7）：926-931.
[25] 刘继新，高庆剑，陆铖，等.同分异构体补骨脂素和异补骨脂素对HepG2细胞及细胞色素P450酶的影响[J].中国临床药理学杂志，2014， 30（5）：438-441.
[26] 袁凤，王蓉，王世民，等.银杏叶提取物及其黄酮类单体对Chang Liver细胞中CYP3A4和CYP2C9的影响[J].中南药学，2013，11（11）：801-806.
[27] 范岚，谢海棠，李智，等.黄芩苷对Chang Liver细胞CYP3A4，CYP2C9和CYP2C19表达的影响[J].中国现代医学杂志，2009，23（19）：3546-3550.
[28] MARTIGNONI M， KANTER R， GROSSI P， et al. An in vivo and in vitro comparison of CYP induction in rat liver and intestine using slices and quantitative RT-PCR[J]. Chemico-Biological Interactions， 2004，151（1）：1-11.
[29] DOSTALEK M， PISTOVCAKOVA J， JURICA J， et al. The effect of St John's wort （hypericum perforatum） on cytochrome P450 1A2 activity in perfused rat liver[J]. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub，2011，155（3）：253-257.
[30] 王启斌，张志权，方建敏，等.哺乳动物CYP450在大肠埃希茵上表达的研究进展[J].医药导报，2008，27（9）：1083-1085.
[31] CHANG J C， WU Y T， LEE W C， et al. Herb-drug interaction of silymarin or silibinin on the pharmacokinetics of trazodone in rats[J]. Chemico-Biological Interactions，2009，182（2/3）：227-232.
[32] PLATZER P， THALHAMMER T， HAMILTON G， et al. metabolism of Camptothecin， a potent topoisomerase inhibitor， in the isolated perfused rat liver[J]. Cancer Chemother Pharmacol，2000，45（1）：50-54.
[33] XIA C H， SUN J G， WANG G J， et al. Differential effect of Shenmai injection， a herbal preparation， on the cytochrome P450 3A- mediated 1-hydroxylation and 4-hydroxylation of midazolam[J]. Chemico-Biological Interactions，2009，180：440-448.
[34] YAMAORI S， OKUSHIMA Y， YAMAMOTO I， et al. Characterization of the structural determinants required for potent mechanism-based inhibition of human cytochrome P450 1A1 by cannabidiol[J]. Chemico-Biological Interactions，2014，215：62-68.
[35] RAMASAMY S， KIEW LIP L V， CHUNG L. Inhibition of human cytochrome P450 enzymes by bacopa monnieri standardized extract and constituents[J]. Molecules，2014，19：2588-2601.
[36] CHIEN C F， WU Y T， LEE W C， et al. Herb-drug interaction of Andrographis paniculata extract and andrographolide on the pharmacokinetics of theophylline in rats[J]. Chemico-Biological Interactions，2010，184：458-465.
[37] ZHANG R， SUN J G， MA L P. et al. Induction of cytochromes P450 1A1 and 1A2 by tanshinones in human HepG2 hepatoma cell line[J]. Toxicology and Applied Pharmacology，2011，252：18-27.
[38] HANDSCHIN C， PODCINEC M， MEYER U A. In silico approaches， and in vitro and in vivo experiments to predict induction of drug metabolism[J]. Drug News Perspect，2003，16（7）：423-434.
[39] Ek M， S?derdahl T， Küppers-Munther B， et al. expression of drug metabolizing enzymes in hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells[J]. Biochem Pharmacol，2007，74（3）：496-503.
