吴琨鹏++易健++彭千元++汤艳++周胜强++刘柏炎
摘要：目的 观察六味地黄汤对快速衰老小鼠认知功能及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）/Notch信号通路表达的影响，探讨其改善认识障碍的作用机制。方法 将小鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照组和六味地黄汤高、中、低剂量组，颈部皮下注射D-半乳糖制作快速衰老小鼠模型，各给药组给予相应药物灌胃。Morris水迷宫系统检测大鼠学习记忆能力，免疫组化检测小鼠脑组织bFGF、Notch1、Hes1的表达。结果 与正常组比较，模型组小鼠潜伏期延长、跨台次数减少（P<0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠潜伏期缩短、跨台次数增多（P<0.01），六味地黄汤高剂量组较六味地黄汤中、低剂量组和阳性对照组效果明显（P<0.01）；各给药组小鼠bFGF、Notch1、Hes1阳性细胞数表达较模型组升高（P<0.05，P<0.01），六味地黄汤高剂量组较六味地黄汤中、低剂量组和阳性对照组升高明显（P<0.01）。结论 六味地黄汤可能通过增加bFGF的表达，激活Notch信号通路，达到改善衰老小鼠认知功能障碍。
关键词：六味地黄汤；认知功能；碱性成纤维细胞生长因子；Notch1；Hes1；小鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.019
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）08-0074-03
衰老是很多慢性疾病的基础，其中老年认知功能障碍发病率较高，严重影响老年人群的生活质量。中医学认为，脑为髓海，灵机记性在脑，肾生髓，通于脑，肾与脑的关系密切，因而改善认知障碍的药物多具有补肾功效[1]。六味地黄汤为滋补肾阴的经典方剂，三补三泻，以补为主，补而不腻，研究显示，六味地黄汤具有健脑益智的作用[2-3]，但具体机制尚不明确。本实验通过建立快速衰老认知功能障碍模型，观察六味地黄汤对衰老小鼠认知功能及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）/Notch信号通路表达的影响，探讨其改善认知障碍的可能机制。
1 实验材料
1.1 动物
昆明种成年小白鼠40只，雄性，健康清洁级，体质量（20±2）g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号SCXK（湘）2011-0003。室温下标准饲料喂养，自由饮水饮食。
1.2 药物及制备
六味地黄汤（熟地黄24 g，山药12 g，泽泻9 g，山萸肉12 g，茯苓9 g，牡丹皮9 g）饮片购自湖南中医药大学杏林药房。传统方法煎煮，六味地黄汤浓缩至4 g原药材/mL，4 ℃冰箱保存备用。维生素E注射液，江西博莱大药厂，批号20140404。
1.3 主要试剂与仪器
D-半乳糖、SP-9000和bFGF、Notch1、Hes1免疫组化试剂盒，武汉博士德生物公司。TP-1000电子天平（湘仪天平仪器厂），水迷宫动物行为学习记忆系统（法国Viewpoint），BX-51光学显微镜及数码摄影数字彩超图像分析仪系统（日本Olympus）。
2 实验方法
2.1 分组、造模及给药
适应性喂养2周后，小鼠死亡4只。余36只随机分为正常组、模型组、阳性对照组和六味地黄汤高、中、低剂量组，每组6只。除正常组外，其余各组小鼠颈部皮下注射D-半乳糖0.5 g/（kg·d），正常组小鼠予生理盐水等体积皮下注射，连续8周，复制快速衰老小鼠模型。60 kg体质量人体表面积临床等效剂量为小鼠六味地黄汤中剂量组给药量，高、中、低剂量组灌胃量分别为2、1、0.5 g/（kg·d），正常组和模型组给予等量蒸馏水灌胃，阳性对照组给予维生素E注射液灌胃。灌胃体积均为10 mL/（kg·d），连续8周。治疗前后均采用Morris水迷宫系统检测大鼠学习记忆能力。第8周行水迷宫实验后所有小鼠断颈处死，取脑组织，免疫组化检测小鼠脑组织bFGF、Notch1、Hes1的表达。
2.2 行为学测试
2.2.1 定位航行实验 每日固定时间段，每个时间段训练4次，连续5 d。第1次将小鼠远离目标象限面向池壁放入池中，记录小鼠找到平台的时间（逃避潜伏期），后3次将小鼠分别从其余3个不同象限放入水中，历时120 s。120 s内找不到平台者潜伏期记录为120 s，每次训练间隔20 s。取其平均值作为小鼠当日的学习成绩。
2.2.2 空间探索实验 第6日撤除平台，将小鼠从任意一区入水，记录小鼠120 s内跨越原平台次数。
2.3 免疫组化检测小鼠脑组织碱性成纤维细胞生长因子、Notch1、Hes1的表达
将保存的脑组织取出，梯度脱水，石蜡封片、切片、烤片，再按试剂盒说明进行免疫组化检测，最后行封片处理，400倍镜下随机选取6个不重复视野，图像分析系统测算阳性细胞表达数量。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，符合正态性及方差齐性者采用方差分析，若方差不齐，则用Tamhane's T2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 六味地黄汤对模型小鼠学习记忆能力的影响
与正常组比较，模型组小鼠平均逃避潜伏期延长、跨台次数减少（P<0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠潜伏期缩短、跨台次数增多（P<0.01），六味地黄汤高剂量组较六味地黄汤中、低剂量组和阳性对照组效果明显（P<0.01）。结果见表1。
地黄汤高剂量组比较，##P<0.01
4.2 六味地黄汤对模型小鼠脑组织碱性成纤维细胞生长因子、Notch1、Hes1表达的影响
与正常组比较，模型组小鼠bFGF、Notch1、Hes1阳性细胞数表达升高，但差异无统计学意义（P>0.05）；各给药组小鼠bFGF、Notch1、Hes1阳性细胞数表达较模型组升高（P<0.05，P<0.01），六味地黄汤高剂量组较六味地黄汤中、低剂量组和阳性对照组效果明显（P<0.01）。结果见表2。
5 讨论
脑衰老所致认知功能障碍属于中枢神经系统退行性变，成年哺乳动物内仍存在神经干细胞，正确选择或开发出能促进神经元再生与重建的药物，通过修复及替代受损神经元，构建新的神经环路改善认知功能，将会给老年认知功能障碍患者带来新的希望。干细胞与中医学先天之精的来源、分布、功能高度相似[4]，肾为先天之本，蛰藏先天之精，而六味地黄汤为滋补肾阴的经典方剂，其具有促进干细胞增殖、分化及益脑健智的作用[5]。
Notch信号通路是在进化过程中一种高度保守的信号转导系统，在哺乳动物中枢神经系统发育参与神经发生过程，决定着中枢神经系统祖细胞是选择继续增殖还是向神经元分化。Notch1则通过Notch信号的改变调控神经干细胞分化为神经元与胶质细胞的比例，Hes1则是Notch信号通路的关键靶基因，神经元分化作用也依赖于Hes1，且Hes1亦可通过调节下游的Mash1来调控成体神经细胞的生成，后者被认为与学习记忆有密切关系[6-8]。Notch1及Hes1表达升高提示Notch通路激活干细胞进入增殖阶段，反之则为干细胞分化为功能细胞[9-11]。
bFGF是一种多肽分子，具有很强的促细胞生长作用很强，广泛分布于中枢神经系统中，能促进神经干细胞增殖，激活不同区域的神经元前体细胞潜在的再生能力。而于内源性神经干细胞分化中，能激活Notch通路，诱导Hes1的表达，使NSCs处于增殖状态，为之后的神经元迁移、分化做好准备[12]。
本实验结果表明，六味地黄汤高剂量组能显著增加bFGF、Notch1、Hes1的表达，改善快速衰老小鼠认知能力。我们认为增加bFGF的表达，激活Notch信号通路，可能为六味地黄汤改善衰老认知功能障碍的机制。
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