段玉敏++张洪娟++刘滨瑞++孟庆杰++刘微
摘要：目的 观察独角莲软胶囊对Hep-2荷瘤裸鼠肿瘤生长的抑制作用及对抑癌基因p53表达的影响，探讨其作用机制。方法 背部皮下接种人肝癌Hep-2细胞悬液制备肿瘤模型。BALB/c裸鼠随机分为模型组、阳性药组和中药高、中、低剂量组，各给药组给予相应药物灌胃，1次/d，连续21 d。监测瘤体积变化，HE染色观察各组瘤组织病理变化，RT-PCR检测各组Hep-2荷瘤裸鼠肿瘤组织p53基因的表达。结果 与模型组比较，各给药组均能抑制肿瘤生长，抑瘤率分别为55.1%、42.8%、30.1%、79.5%，p53基因表达上调；病理观察结果显示，模型组肿瘤细胞数目增多、体积增大、胞质疏松、核深染，各给药组均有不同程度的核固缩、淡染、毛细血管数目减少和局灶性坏死。结论 独角莲软胶囊具有抑制人肝癌生长作用，其机制可能与上调p53基因的表达导致细胞凋亡有关。
关键词：独角莲软胶囊；抗肿瘤；p53基因表达；裸鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.07.016
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）07-0061-04
Inhibitory Effects of Typhonium Giganteum Soft Capsules on Transplantation Tumor and expression of p53 Gene in Human Liver Cancer Hep-2 Tumor-bearing Nude Mice DUAN Yu-min1， 2， ZHANG Hong-juan2， LIU Bin-rui2， MENG Qing-jie2， LIU Wei2 （1. Shenyang Normal University， Shenyang 110000， China； 2. Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine， Harbin 150030， China）
Abstract： Objective To observe the inhibitory effects of Typhonium Giganteum soft capsules on tumor growth in Hep-2 tumor-bearing nude mice and its effects on the expression of tumor suppressor p53 gene； To discuss its mechanism of action. Methods Human liver cancer Hep-2 cell suspension back subcutaneous vaccination was conducted to prepare tumor models. BALB/c nude mice were randomly divided into model group， cisplatinum group， and TCM high-， medium-， and low-dose groups. Each group was given relevant medicine for gavage， once a day for 21 days. Growth changes of tumor volume were monitored； HE staining was used to observe pathological changes of tumor tissues； RT-PCR was used to detect the expression of p53 gene in tumor tissue of Hep-2 nude mice. Results Compared with the model group， all medication groups could inhibit the tumor growth， and the anti-tumor rates were 55.1%， 42.8%， 30.1%， and 79.5%， respectively； the expression of p53 gene increased； pathological observation results showed that the number and the volume of tumor cells increased， with cytoplasm rarefaction and nucleus anachromasis. All medication groups had karyopyknosis， slight staining， and decreasing blood capillary and focal necrosis in varying degrees. Conclusion Typhonium Giganteum soft capsules can inhibit the growth of human liver cancer， and its mechanism may be associated with the up-regulating expression of p53 gene leading to apoptosis.
Key words： Typhonium Giganteum soft capsules； anti-tumor； expression of p53 gene； nude mice
我国肝癌死亡率位居世界第2，男性发病率明显高于女性[1]。目前肝癌患者中大部分失去手术指征，肝功能异常并伴有机体其他症状，对放化疗的敏感性
基金项目：哈尔滨市科技局科技创新人才项目（2013RFXYJ017）
通讯作者：张洪娟，E-mail：zhanghongjuan966@sina.com
降低。近年来，中医药治疗可有效改善肿瘤患者的全身状况，调节机体免疫力，达到延长生存期和提高生活质量的目的[2-3]。独角莲Typhonium Giganteum Engl.为天南星科梨头尖属植物，具有祛风痰、定惊搐、解毒散结、止痛的功效。临床用于治疗中风痰壅所致半身不遂、脑血管病、偏头痛、颈淋巴结核、慢性支气管炎、癫痫、外科感染等[4-5]。本实验采用背部皮下接种人肝癌Hep-2细胞悬液制备肿瘤模型，观察独角莲软胶囊对Hep-2荷瘤裸鼠肿瘤生长的抑制作用及对肿瘤组织抑癌基因p53表达的影响，探讨其作用机制。
1 材料与方法
1.1 动物
SPF级BALB/c-nu雄性裸小鼠30只，5～6周龄，体质量18～20 g，中国医学科学院实验动物研究所，合格证号SCXK（京）2005-0013，饲养于哈尔滨医科大学肿瘤防治病研究所SPF级动物室。
1.2 细胞株
Hep-2肝癌细胞株，哈尔滨医科大学肿瘤防治研究所。
1.3 药物及制备
独角莲软胶囊，黑龙江省中医药科学院中药所，批号201300901。独角莲药材30%乙醇渗滤，大孔树脂纯化精制得活性部位，加入大豆油等辅料制备软胶囊；顺铂，山东齐鲁制药有限公司，批号20130518。
1.4 主要试剂与仪器
1640培养基，赛默飞世尔生物制品有限公司；胰酶，美国Gibco公司；胎牛血清，美国Hyclone公司；Trizol，美国Invitrogen公司；Life Technologies，Inc反转录试剂盒，TaKaRa公司；Marker和p53引物，大连宝生物有限公司。生物安全柜，北京东联哈尔滨仪器制造有限公司；CO2培养箱，日本Yamato；荧光倒置显微镜，Olympus公司；电子分析天平，沈阳龙腾电子有限公司；电泳仪，北京六一仪器厂；PeqSTAR 384高通量PCR仪，德国Peqlab GmbH 公司；离心机，长沙湘仪离心机有限公司；立式压力蒸汽消毒器，上海申安医疗器械厂；组织切片机，上海圣科仪器设备有限公司。
1.5 造模
人肝癌细胞株Hep-2，经传代培养达到实验用量，经胰酶消化后，台盼蓝染色，镜下活细胞计数，用生理盐水调整为5.5×107个/mL细胞密度的单细胞悬液。无菌条件下，用特制接种套针吸取瘤细胞悬液，接种于裸小鼠经常规消毒后的背部皮下，0.2 mL/只。7 d后裸小鼠背部皮下出现瘤体积约100 mm3的移植瘤，即造模成功。
1.6 分组及给药
将成模小鼠随机分为模型组、阳性药组（4 mg/kg）和中药高、中、低剂量组，每组6只。阳性药组腹腔注射顺铂，每周2次；中药高、中、低剂量组分别给予独角莲药液0.52、0.26、0.13 g/kg灌胃，模型组给予等量生理盐水灌胃。给药体积均为0.2 mL/10 g，1次/d，连续21 d。
1.7 观察指标及方法
1.7.1 一般观察 每日观察裸鼠饮食、活动及生长状况；每周电子天平测量裸鼠体质量，游标卡尺检测瘤体积。瘤组织称重后计算抑瘤率。抑瘤率（%）=（模型组平均瘤质量-用药组平均瘤质量）÷模型组平均瘤质量×100%。
1.7.2 动态观察肿瘤生长 各组裸鼠每周测1次瘤径。计算每只裸鼠瘤体积。
瘤体积V（mm3）=0.5×a×b2（V为肿瘤体积，a为长径，b为宽径）
1.7.3 病理观察 将瘤组织用10%福尔马林固定过夜，梯度乙醇70%、80%、90%、100%脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，HE染色镜下观察。
1.7.4 p53基因表达测定 取-70 ℃冻存的肿瘤组织100 mg，液氮研磨成粉末，按RNAprep说明书提取总RNA，于酶标仪波长260、280 nm处测定OD值，计算RNA浓度。按照Life Technologies，Inc试剂盒说明略加改进反转录合成cDNA，以cDNA为模板扩增β-actin和p53片段。所用p53 Forward：5'-TGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3'；Reverse：5'-TCA CTTGTGGCTCAGATAGG-3'，扩增长度280 bp。β-actin Forward：5'-CGTCTGGACCTGGCTGGCCGG GACC-3'；Revers：5'-CTAGAAGCATGCGGTGGACG ATG-3'，扩增长度600 bp。扩增条件：94 ℃变性60 s，57 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共进行35个循环，最后72 ℃延伸7 min，4 ℃条件下结束反应。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳紫外灯检测DNA并照相，用Image软件分析各电泳条带灰度积分，以β-actin灰度积分作为标准校正，进行半定量分析。
1.8 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，组间比较采用方差分析，两组间均数比较采用LSD-t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 独角莲软胶囊对模型小鼠生长状况及体质量的影响
裸鼠接种Hep-2细胞株7 d后可见直径约6 mm的瘤结节。模型组裸鼠随瘤体积的迅速增长，饮食、饮水、活动和反应能力逐渐变差，呈恶病质状，而中药各剂量组裸鼠瘤体积增长相对缓慢且饮食、行为、反应能力、营养状况良好，阳性药组瘤体积增长极为缓慢且饮食、饮水、活动减少、皮肤青紫、反应能力较差。给药前后模型组和阳性药组体质量明显减轻，中药各剂量组体质量增加，与模型组、阳性药组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表1。
2.2 独角莲软胶囊对模型小鼠肿瘤生长的影响
独角莲软胶囊干预后移植瘤生长较前减慢，给药后期作用尤为显著，呈一定剂效关系，抑瘤率分别为55.1%、42.8%、30.1%和79.5%。中药中、低剂量组与阳性药组瘤质量比较差异有统计学意义（P<0.05）。结果见图1、表1。
2.3 独角莲软胶囊对模型小鼠肿瘤组织形态学的影响
模型组癌细胞数量明显增加，胞浆较少，胞核体积增大、不规则，毛细血管数量增加，血液供应丰富；中药高剂量组癌细胞数量明显减少，核固缩，染色质淡染，间质纤维细胞增加，毛细血管数量减少；中药低剂组癌细胞数量较中药高剂量组增加，周边现淋巴细胞，浆细胞浸润；阳性药组癌细胞数量明显减少，核溶解，染色质较淡染，细胞间间质成分增加。结果见图1。
2.4 独角莲软胶囊对模型小鼠肿瘤组织p53基因表达的影响
各给药组p53基因表达较模型组均上调，其中中药高剂量组和阳性药组上调明显（P<0.05）。结果见表2、图3。
3 讨论
中医药在“带瘤生存”治疗中具有明显的优势，其治疗效果并不追求肿瘤体积的缩小，而是力求使瘤细胞处于休眠状态，做到癌肿无论体积多大，不发生向机体各器官侵袭转移，如同良性肿瘤一样，不活动、不进展，只是一个占位病变而已，并不足以对生命构成威胁。近年来，临床上应用独角莲抗肿瘤的报道相对较少，仅停留于抗肿瘤的基础研究层面。如黄氏等[5]通过体内实验显示，独角莲醇提液能明显提高H22荷瘤鼠血清肿瘤坏死因子-α水平。客氏等[6]通过体外实验显示，独角莲药物血清具有抑制K562白血病细胞增殖、促进细胞分化和诱导细胞凋亡的作用。何氏等[7]研究显示，独角莲块茎提取液对宫颈癌Hela细胞系有体外杀伤作用。本实验结果表明，模型组荷瘤小鼠随瘤体积的迅速增长生活质量明显降低，表现出恶病质状，中药低剂量组瘤体积增长虽较快，但生活质量优于模型组，中药高、中剂量组随给药时间的延长瘤体积增长明显减慢且生存质量明显提高，阳性药组瘤体积增长虽十分缓慢但出现化疗后的全身机能降低、生活质量下降。病理观察结果显示，各给药组瘤细胞数目、毛细血管数量均较模型组明显减少，细胞核淡染，提示独角莲软胶囊具有抗肿瘤活性且呈现一定的剂量依赖效应，其抑制率亦随剂量增加而提高，差异有统计学意义（P<0.05）。
肝癌的发生与其细胞凋亡障碍密切相关，肿瘤分子生物学研究表明，p53在调节细胞凋亡中起关键作用。p53基因可分为野生型和突变型2种。野生型p53为正常p53，属于抑癌基因，对防止机体癌变具有保护性作用，又被称为“基因卫士”，当机体组织遭受不同的外来刺激引起DNA损伤或染色体变异时，p53被激活，然后通过一系列转录激活相应的目的基因，使病变细胞生长停滞，抑制病变细胞过度增殖，同时进行DNA修复[8]。若不能修复，启动凋亡程序，促进Bax基因及Fas基因的转录，阻断Bcl-2及Mcl基因的抑制凋亡作用，最终主要通过活化半胱氨酸蛋白酶导致细胞凋亡[9-11]。当野生型p53基因突变产生突变型p53蛋白，其结构发生改变，其在细胞核内堆积，或本身获得了类似癌蛋白的功能，使细胞增殖处于失控状态，导致肿瘤发生[12]。本实验中检测的p53是野生型p53基因，结果中药高剂量组和阳性药组p53表达均较模型组明显增加，表明该药可上调p53的表达，直接或间接诱导细胞凋亡，发挥抗瘤作用。
综上所述，独角莲软胶囊在动物体内具有抑制人肝癌细胞Hep-2裸鼠皮下移植瘤的作用，其作用机制与p53诱导细胞凋亡密切相关。
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（收稿日期：2015-08-26）
（修回日期：2015-09-15；编辑：华强）
