李慧++王雪蕊++杨静雯++杜斯琪++朱雯++姬彩硕++刘存志
摘要：目的 观察针刺对血管性痴呆（VD）大鼠海马突触传递相关信号分子蛋白激酶C（PKC）、钙调蛋白激酶（CaMKⅡ）、N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基（NR2B）的影响，探讨针刺治疗VD的分子机制。方法 采用栓子注入方法制作多发性脑梗死痴呆模型，实验大鼠随机分为正常组、模型组、针刺组和非穴组。针刺组针刺“足三里”治疗，非穴组于肋下髂嵴上10 mm（非穴）处针刺治疗，正常组和模型组大鼠施以与针刺组和非穴组相同强度的捉抓刺激。治疗结束后，ELISA检测PKC活性，Western blot检测CaMKⅡ蛋白表达；免疫组化检测CA1、CA3及DG区NR2B蛋白表达。结果 VD大鼠海马PKC活性、NR2B蛋白表达较正常组显著下降（P<0.01）；针刺治疗后，PKC活性明显上升（P<0.05），NR2B蛋白表达水平有上升的趋势。各组CaMKⅡ蛋白表达无明显变化。结论 针刺增强海马神经元突触传递信号分子PKC活性，这可能是其治疗VD的重要分子靶点之一。
关键词：针刺；血管性痴呆；海马；组织蛋白激酶C；钙蛋白激酶；N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.07.020
中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）07-0077-05
Effects of Acupuncture on Hippocampal Synaptic Transmission Signal Molecules in Rats with Vascular Dementia LI Hui1， WANG Xue-rui2， YANG Jing-wen2， DU Si-qi2， ZHU Wen2， JI Cai-shuo2， LIU Cun-zhi2 （1. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 300193， China； 2. Acupuncture and Moxibustion Department， Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Capital Medical University， Beijing 100010， China）
Abstract： Objective To observe the effects of acupuncture on synaptic transmission signal molecules in rats with vascular dementia （VD）， such as PKC， CaMKⅡ and NR2B， and discuss the molecular mechanism of acupuncture treatment for VD. Methods The multi-infarct dementia model was established by injection of emboli into the internal carotid artery. Experimental rats were randomly divided into normal group， model group， acupuncture group and non-acupoint group. For acupuncture group， acupuncture needles were penetrated into bilateral Zusanli. Non-acupoint group was given acupuncture treatment at the bilateral hypochondrium （10 mm above iliac crest）. The rats in normal group and model group were performed to the same amount of capture stimulation as the acupuncture and non-acupoint groups. After treatment， the hippocampal PKC activity was detected by ELISA. Western blot was used to detect CaMKⅡ expression， and the protein expression of NR2B in CA1， CA3 and DG zones was assayed by immunohistochemical staining. Results Compared with normal group， PKC activity and NR2B expression in the hippocampus significantly decreased in the model group （P<0.01）. After the acupuncture treatment， PKC activity increased significantly （P<0.05）， and the protein expression of NR2B showed a trend to increase. There was no obvious difference in CaMKⅡ expression among all groups. Conclusion Acupuncture at Zusanli can enhance the activity of hippocampal PKC， a synaptic transmission signal molecule， which maybe one of the important molecular targets for the treatment of VD.
Key words： acupuncture； vascular dementia； hippocampus； PKC； CAMKⅡ； NR2B； rats
基金项目：国家重点基础研究发展计划（2014CB543203）；北京市科技新星计划（2014B063）
血管性痴呆（vascular dementia，VD）是由于脑血管病导致脑组织损害引起的以认知障碍为主要临床表现的痴呆综合征。近年来随着人口的老龄化，VD发病渐有上升趋势。VD是仅次于阿尔茨海默病的第2位常见痴呆病。据世界卫生组织报道，2012年患痴呆的人数达0.356亿，2050年预计翻3倍[1]。2010年美国用于痴呆的花费超过了癌症和心脏疾病[2]，是家庭和社会的沉重负担。既往研究表明，针刺能改善中风患者和多发性脑梗死大鼠的认知功能[3-4]。长时程增强效应（LTP）是突触传递效能的主要表现形式，反映突触水平的信息存储过程，是学习记忆的分子基础[5]。蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），钙调蛋白激酶（calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）和N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基（N-melthyl-D-asparticacid receptor 2B subunit，NR2B）是重要突触传递相关信号分子，在学习记忆的形成和LTP的产生中发挥重要作用。本研究采用栓子注入模型，观察针刺治疗对突触传递相关信号分子的影响，探讨针刺改善认知损害的分子机制。
1 实验材料
1.1 动物
10周龄SPF级雄性Wistar大鼠56只，体质量280～300 g，北京维通利华技术有限公司，许可证号SCXK（京）2012-0001。饲养于中国中医科学院基础理论研究所SPF级动物实验室。
1.2 主要试剂及仪器
水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司），PKC活性试剂盒（瑞士Enzo life sciences公司），CaMKⅡ抗体（美国Upstate Biotechnology公司），GAPDH（北京康为世纪生物科技有限公司），二抗（美国Cell Signaling Technology公司），兔抗鼠NR2B一抗（美国Millipore），二步法抗兔/鼠通用型二抗试剂盒（上海基因科技有限公司）。电泳仪（北京六一仪器厂），凝胶成像仪Tanon EPS300（上海天能科技有限公司），冰冻切片机（德国Leica 公司），BX51型光学显微镜（日本Olympus），DHG-9023A烤箱（上海林频仪器股份有限公司），离心机（美国Beckma）。
2 实验方法
2.1 分组
56只大鼠随机分为正常组、模型组、针刺组和非穴组，每组14只。
2.2 造模
采用栓子注入方法复制多发性脑梗死痴呆模型[6]。取同种大鼠颈总动脉采血，无菌条件下于37 ℃恒温箱内自然干燥36 h，用100、80目筛子过筛，制备直径100～200 μm的血凝块备用。应用时每10 mg血凝块加0.3 mL生理盐水制成栓子悬浊液。大鼠麻醉后颈正中切开皮肤，暴露颈总动脉、颈外动脉与颈内动脉，用儿科0.45 mm头皮针针头逆行穿刺右颈外动脉至右颈内动脉起始处，随即用1 mL注射器缓慢注入栓子悬浊液0.3 mL，造成多灶性脑梗死，然后结扎颈外动脉，缝合皮肤。切口涂抹庆大霉素预防感染。
2.3 干预
造模后第3日进行干预，针刺组取穴参照文献[7]。取双侧“足三里”，行捻转补法各30 s。非穴组大鼠选取其双侧肋下一个固定非穴点（肋下髂嵴上10 mm）作为对照刺激点，行平补平泻捻转手法各30 s。每日1次，治疗6 d，休息1 d，2周共治疗12次。正常组和模型组行与针刺组和非穴组相同时间、相同程度的捉抓刺激。
2.4 指标检测
治疗结束后第2日，各组大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛（35 mg/100 g体质量）麻醉。一部分大鼠麻醉后断头快速取出脑组织，分离出海马，-80 ℃冰箱保存，用于PKC活性和CaMKⅡ蛋白表达的测定。另一部分大鼠麻醉后，4%多聚甲醛灌注固定，然后断头取出脑组织，35%蔗糖脱水后切片，用于NR2B蛋白表达的测定。
2.4.1 蛋白激酶C活性测定 每1 g海马加5 mL裂解液，冰浴条件下手动匀浆使其溶解，用微型离心机4 ℃、15 000×g离心30 min，取上清液置于-80 ℃冰箱保存备用。BCA法进行蛋白定量后， ELISA检测。加50 μL激酶缓冲液/孔，室温10 min，吸出。上样30 μL，空白孔加入激酶缓冲液，阳性对照加入PKC溶液。加10 μL ATP/孔，30 ℃、孵育90 min。停止反应后再吸出，加40 μL磷酸化特异性抗体/孔，室温孵育60 min，洗孔后，加40 μL抗兔抗体/孔，室温孵育30 min，洗孔后，加60 μL TMB/孔，室温孵育30～60 min，观察颜色变化由蓝变黄，加20 μL停止液/孔，停止反应。于酶标仪波长450 nm处测定吸光度（OD）值。实验组OD值与正常组OD值的之比表示PKC活性。
2.4.2 钙调蛋白激酶蛋白表达测定 Western blot检测CaMKⅡ蛋白表达。每组蛋白取2 μg上样于10%SDS-PAGE胶，电泳2 h；用湿转移的方法转印到PVDF膜上，转完后将膜用5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h；加入特异性的一抗，4 ℃孵育过夜；TBST液漂洗4次（5 min/次），加二抗，室温孵育1 h，TBST液漂洗后，采用Odyssey近红外双色激光成像分析软件处理，记录每条蛋白电泳带的平均光密度值，进行定量分析。
2.4.3 NR2B蛋白表达测定 免疫组化染色检测NR2B的蛋白表达。将切片用PBS冲洗后，置于3%双氧水溶液中室温孵育10 min，去除内源性过氧化物酶；再将切片用PBS冲洗3次（5 min/次），用正常山羊血清封闭液室温下封闭0.5 h，将切片置于兔NR2B一抗（1∶200，PBS稀释），4 ℃过夜。室温静置0.5 h，PBS充分冲洗后，将切片置于抗兔二抗稀释液（1∶200），室温孵育1 h；用PBS冲洗后，DAB显色剂（1∶20）显色2 min，再用苏木精溶液复染。置于75%盐酸乙醇10 s，蒸馏水冲洗10 min后，乙醇梯度脱水，二甲苯透明封片。
3 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 针刺对大鼠海马蛋白激酶活性的影响
与正常组比较，模型组大鼠海马PKC活性显著下降（P<0.01）；针刺治疗后，海马PKC活性显著增加，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结果见图1。
4.2 针刺对大鼠海马钙调蛋白激酶蛋白表达的影响
与正常组比较，各组大鼠海马CaMKⅡ蛋白表达均无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。结果见图2。
4.3 针刺对大鼠海马CA1、CA3和DG区NR2B蛋白表达的影响
NR2B免疫组化染色阳性表达产物呈棕黄色，位于胞浆与胞核内。正常组大鼠海马神经元内NR2B表达明显，胞核和胞质内均可见大量圆形或椭圆形棕黄色颗粒，模型组NR2B着色最淡，阳性表达下降，神经元排列较紊乱，针刺组和非穴组阳性表达有所增加，神经元排列较整齐，见图3。与正常组比较，模型组大鼠海马CA1、CA3和DG区NR2B蛋白表达显著降低（P<0.05）；与模型组比较，针刺组大鼠海马CA1、CA3和DG区NR2B蛋白表达有上升的趋势（P>0.05）。结果见表1。
5 讨论
大约1/3中风生还者（>60岁）在中风后3个月内发展成为VD[8]。VD的高发病率以及血管因素可能导致老年性痴呆的现实，使VD的预防和治疗成为关注的焦点。针灸作为传统医学的重要组成部分具有特异性和整体性的双重特点，操作简单，无不良反应，适应证广泛，是一种具有开发潜力的非药物治疗方法。VD属中医学“痴呆”“呆病”范畴，病位在脑，与心、肝、脾、肾相关。基本病机为髓减脑消，神机失用，以气血、肾精亏虚为本，痰浊、瘀血为标，临床多见虚实夹杂之证。年老久病而肾精亏损，脑髓失充且脾胃虚弱，气血生化乏源，加之痰瘀痹阻、七情内伤、气滞血瘀，蒙蔽清窍而致呆滞愚笨。阳明者，五脏六腑之海，足阳明胃经为多气多血之经脉。足三里为足阳明胃经合穴，是补中益气之要穴。针刺足三里可调补全身脏腑气血，濡养脑髓，有助于学习记忆功能的改善。课题组前期研究表明，针刺足三里能改善VD大鼠的空间学习和记忆能力[9-10]。
突触传递是中枢神经系统信息传递的基础，在学习和记忆的形成过程中发挥重要作用。PKA、PKC和CaMKⅡ是重要的蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶，通过使底物蛋白的丝氨酸/苏氨酸磷酸化，启动相关信号传导通路，在海马依赖的学习记忆和突触可塑性中扮演重要角色[11-12]。研究发现，记忆力减退患者会出现大脑神经元PKC级联信号的缺失[13]。选择性敲除PKC-β和PKC-γ亚基后，小鼠的学习记忆能力和突触可塑性明显降低[14-15]。在缺血大鼠上，激活CaMKⅡ能使其自身磷酸化，启动CaMKⅡ与NMDAR的结合位点，上调LTP，改善学习记忆[16-17]。我们前期研究表明，针刺能激活蛋白激酶PKA活性，上调LTP，改善多发性脑梗死痴呆大鼠的认知功能[3]。本实验结果显示，模型组大鼠海马区PKC活性较正常组显著降低，针刺治疗后PKC活性显著增强，表明针刺能增强多发性脑梗死大鼠海马区PKC的活性，发挥改善认知的作用。各组海马CaMKⅡ的蛋白表达无明显差异，可能与缺血时间相关。慢性脑缺血再灌注是一个复杂的过程，在急性缺血期，神经元的钙超载可使CaMKⅡ表达增加，随着缺血时间的延长，海马神经元死亡或结构受损，蛋白表达程度将逐渐减弱[18]。
NR2B是NMDA受体重要的亚单位，能调控海马神经元LTP。注射一定剂量的NR2B抑制剂能阻断LTP的产生。研究发现，随着NR2B的表达增加，海马CAl区的LTP也会随之增强，从而增强空间记忆[19]。缺乏NR2B亚基的小鼠具有选择性空间工作记忆的障碍，NR2B高表达的转基因老年小鼠的空间记忆能力明显提高[20]。本实验观察到模型组海马CA1、CA3、DG区NR2B蛋白表达较正常组显著降低。尽管针刺治疗后，NR2B蛋白表达水平与模型组比较未见明显差异，但有上升的趋势，表明针刺对VD大鼠海马NR2B的蛋白表达具有一定的调节作用。
综上所述，针刺可增强海马神经元突触传递信号分子PKC活性，这可能是其治疗VD的重要机制之一。
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（收稿日期：2015-12-01）
（修回日期：2015-12-29；编辑：华强）
