李康宁 王蕾 于佳佳 樊永平
摘要：目的 应用网络药理学方法分析补肾益髓胶囊主要组成药物的核心组分及治疗多发性硬化可能的分子作用机制，为中药复方研究提供参考。方法 检索中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）收录的补肾益髓胶囊主要组成药物（熟地黄、连翘、大黄、益母草、浙贝母）的化学成分，进行吸收、分布、代谢、排泄（ADME）分析，预测化合物对应的作用靶点。以口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18或节点度≥5筛选核心化合物，采用Cytoscape3.2.0构建核心化合物-靶点网络，筛选多发性硬化相关靶点及对应化合物信息。运用STRING数据库构建靶蛋白互作网络，并进行KEGG信号通路富集和GO功能富集。结果 筛选出核心组分23种、疾病相关靶点43个、GO生物过程229个、代谢通路54条。结论 补肾益髓胶囊治疗多发性硬化主要从调节炎症因子、生长因子，调节细胞免疫，促进髓鞘、轴突再生等方面发挥作用，具有多成分、多靶点的特点，与多条信号通路存在直接或间接关系，是多因素诱导的综合效应。
关键词：补肾益髓胶囊;多发性硬化;网络药理学;核心组分;靶点
中图分类号：R255.6;R285 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2019）05-0098-07
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.05.021 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Abstract： Objective To explore the core components of Bushen Yisui Capsules and the possible molecular mechanism of treating multiple sclerosis by using network pharmacology; To provide references for research on compound TCM. Methods The main components of Bushen Yisui Capsules （Rehmannize Radix Praeparata， Forsythiae Fructus， Rhei Radix et Rhizoma， Leonuri Herba， and Fritiliariae Thunbergii Bulbus） were retrieved from TCMSP for ADME （absorption， distribution， metabolism， excretion） analysis， and target corresponding compounds were predicted. Core compounds with OB ≥ 30%， DL ≥ 0.18， or nodality ≥ 5 were screened. The core compound-target network was constructed using Cytoscape 3.2.0 to screen multiple sclerosis-related targets and corresponding compound information. STRING database was used to construct a target protein interaction network， and KEGG signaling pathway enrichment and GO function enrichment were conducted. Results Totally 23 core components， 43 disease-related targets， 229 GO biological processes， and 54 metabolic pathways were screened out. Conclusion Bushen Yisui Capsules for the treatment of multiple sclerosis mainly plays a role in regulating inflammatory factor and growth factors， regulating cellular immunity， promoting myelin and axon regeneration， and has multi-component and multi-target characteristics. The mechanism has a direct or indirect relationship with multiple signaling pathways， which is the combined effect of multi-factor induction.
Keywords： Bushen Yisui Capsules; multiple sclerosis; network pharmacology; core components; target
多發性硬化（multiple sclerosis，MS）是一种免疫介导的中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病，我国MS患者以中青年为主，临床以反复发作、缓解与复发并存为特征，致残率及复发率高，预后不佳。2018年5月22日，MS被纳入国家卫生健康委员会等五部委联合发布的《第一批罕见病目录》，充分表明MS日渐受到社会各方面的重视。经多年临床实践，我们认为MS多以肾虚血瘀痰阻为基本病机，属中医学“痿证”范畴，进而确立补益肝肾、祛瘀化痰的基本治法，并创立了补肾益髓胶囊[1-2]。补肾益髓胶囊组成药物为生地黄、熟地黄、制何首乌、浙贝母、天麻、连翘、酒大黄、益母草、水蛭、全蝎。临床研究发现，补肾益髓胶囊可明显改善神经功能缺失症状，减少复发，减轻激素或免疫抑制剂的不良反应[1]。目前对中药复方的研究方法很多，大致分为化学研究、靶点研究和基于系统生物学的研究3种模式。网络分析方法的提出为研究多组分、多靶点协同的中药药理机制提供了新思路。本研究采用网络药理学分析方法探索补肾益髓胶囊核心组分及分子作用机制。
1 资料与方法
检索中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）中补肾益髓胶囊组成药物。该数据库目前仅提供了熟地黄、浙贝母、连翘、大黄、益母草这5种药物的数据信息，我们委托TCMSP团队对方中另5种药物生地黄、制何首乌、天麻、全蝎、水蛭的化合物成分进行数据挖掘分析，发现生地黄、制何首乌、天麻的主要化合物成分与上述5种药物主要化学成分有较多重合，尤其是君药熟地黄和生地黄存在高度的相似性。而全蝎和水蛭属于动物类药，异源蛋白和氨基酸成分较多，故将这类成分舍弃不用。综合考虑，用熟地黄、浙贝母、连翘、大黄、益母草的主要成分可基本涵盖整个组方。
因此选取上述5种药物为研究对象，检索数据库收载的成分，并利用TCMSP靶点预测模型预测可能的作用靶点。应用Cytoscape3.2.0构建补肾益髓胶囊主要组成药物的化合物-靶点网络，网络图中的节点表示化合物分子、靶蛋白，边表示化合物分子和靶蛋白之间的关系，度越大表明该节点与其他节点连接的紧密性越高、位置越重要、越容易成为核心节点。利用network analyzer分析网络特征。对各成分进行吸收、分布、代谢、排泄（ADME）分析，参考参数包括重均分子量（MW）、亲油性（AlogP）、氢键供体（Hdon）、氢键受体（Hacc）、口服生物利用度（OB）、血脑屏障（BBB）、类药性（DL）等。以OB≥30%、DL≥0.18或节点度≥5为条件筛选核心化合物。将节点度≥5的靶点建立靶点-疾病网络，找出与MS直接相关靶点，对应找出核心化合物-靶点网络中与上述靶点相对应的化合物，加上核心化合物-靶点网络中度数≥16的化合物，共同组成候选核心组分。
应用STRING数据库构建靶蛋白互作（PPI）网络分析候选核心组分对应靶点间的相互作用，设置“Homo Sapiens（人类）”进行操作，其余参数保持默认设置。以PPI网络连线的粗细代表互相作用的强弱，靶点的度表示互相作用的靶点个数。通过对KEGG信号通路富集和GO功能富集分析，诠释候选核心组分的主要代谢通路、生物过程和基因信息，分析补肾益髓胶囊治疗MS可能的分子作用机制。
2 结果
2.1 核心化合物
检索得到熟地黄、制何首乌、浙贝母、连翘、大黄、益母草包含的化合物分别为76、17、150、92、51个。ADME分析得到核心化合物分子性质见表1。
2.2 核心化合物-靶点网络
共收集补肾益髓胶囊主要化合物239种进入化合物-靶点网络分析。经OB、DL及节点度筛选，共得到核心化合物88种，其中58种化合物有相应的靶点信息，节点度≥8的核心化合物见表2。构建补肾益髓胶囊核心化合物-靶点网络，得到357个节点、980条边，见图1。
2.3 核心化合物靶点-疾病网络
选择核心化合物-靶点网络节点度≥5的靶点进行靶点-疾病网络分析，得到相关靶点57个，其中43个靶点在数据库中有相应的疾病信息，构建靶点-疾病，得到223个节点、256条边，见图2。
2个靶点直接与MS相关，分别是peroxisome proliferator activated receptor gamma（238號）、beta-2 adrenergic receptor（766号）。与238号相关的化合物包括quercetin（槲皮素）、kaempferol（堪非醇）、wogonin（汉黄芩素）、isorhamnetin（异鼠李素）、pelargonidin（天竺葵苷元）、（2R，3R，4S）-4-（4-hydroxy-3- methoxy-phenyl）-7-methoxy-2，3-dimethylol-tetralin-6-ol;与766号相关的化合物包括quercetin、wogonin、beta-sitosterol（β-谷甾醇）、stigmasterol（豆甾醇）、arctigenin（牛蒡子苷元）、（2R，3R，4S）-4-（4-hydroxy-3- methoxy-phenyl）-7-methoxy-2，3-dimethylol-tetralin-6-ol、（3R，4R）-3，4-bis[（3，4-dimethoxyphenyl）methyl]oxolan-2- one、galeopsin（鼬瓣花二萜）、（+）-pinoresinol monomethyl ether（（+）-松脂醇单甲醚）、（-）-phillygenin（（-）-连翘苷元;连翘脂素）、preleoheterin（前益母草乙素）、secoisolariciresinol（开环异落叶松脂素）、arctiin（牛蒡子苷）、（+）-pinoresinol monomethyl ether-4-D-beta- glucoside_qt（（+）-松脂醇单甲醚-4-D-beta-糖苷）、FORSYTHINOL（连翘醇）、Zhebeiresinol（浙贝素）。
2.4 补肾益髓胶囊候选核心组分筛选
选择网络度≥16的核心化合物及与MS相关的靶点所对应的主要化合物，由此确定候选核心组分的研究范围：quercetin、kaempferol、luteolin（毛地黄黄酮）、ursolic acid（熊果酸）、wogonin、beta-sitosterol、arachidonic acid（花生四烯酸）、isorhamnetin、stigmasterol、bicuculline（荷包牡丹碱）、aloe-emodin（芦荟大黄素，芦荟泻素）、arctigenin、rutin（芦丁）、astragalin（紫云英苷）、EUPATIN（泽兰黄醇素）、pelargonidin（天竺葵苷元）、galeopsin（鼬瓣花二萜）、（-）-phillygenin、preleoheterin、Secoisolariciresinol、arctiin、FORSYTHINOL、Zhebeiresinol，共23种。
2.5 候选核心组分相关靶蛋白互相作用网络
23种候选核心组分对应靶点建立的PPI网络共包含253个节点、4753条边，平均节点度数37.6，其中5个节点与其他节点无相互关系，故纳入248个节点进行分析，见图3。18种蛋白的网络连接度>100，参数信息见表3，节点度≥80的主要靶点见图4。
2.6 候选核心组分KEGG代谢通路
错误发现率（FDR）<0.05的代谢通路163条，排除与神经系统无关通路，54条可能与候选核心组分药效机制相关，其中Neuroactive ligand-receptor interaction、Neurotrophin signaling pathway与神经系统功能密切相关。基因数排序见图5，通路信息见表4。
2.7 候选核心组分相关GO功能富集分析
FDR<0.05的GO生物过程共229个，根据参与生物过程包含的基因数排列。其中分子功能（基因数195）、结合（基因数189）、蛋白结合（基因数152）、离子结合（基因数130）、催化活性（基因数108）等生物过程有较多靶蛋白参与。GO功能富集生物过程基因数排序见图6。前20个生物过程见表5。
3 讨论
补肾益髓胶囊（又名“二黄方”“二黄胶囊”），具有补益肝肾、祛瘀化痰功效，前期研究表明其可明显改善神经症状、减轻激素不良反应、降低近期复发率，明显改善MS患者的生存质量[1]。补肾益髓胶囊能上调MS急性期患者脑脊液转化生长因子（TGF）-β1[2]，还可通过下调血浆中肿瘤坏死因子（TNF）-α、上调IL-12 p40的表达发挥作用[3]，这与候选核心组分靶蛋白PPI网络筛选结果相吻合，且TNF-α、TGF-β1节点度数均较高，表明在分子机制中贡献较大。发病高峰期和恢复期NK细胞和多种细胞因子含量变化还提示补肾益髓胶囊可能通过调节NK细胞、IL-6发挥治疗作用[4]。补肾益髓胶囊可上調实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）大鼠中枢神经系统TGF-β免疫组织化学表达，促进疾病恢复，并可显著降低脑和脊髓组织γ-干扰素（IFN-γ）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达，疗效优于激素[5]。此外，还可上调EAE大鼠血浆IL-4水平[6]及下调急性期血浆TNF-α水平[7]，对EAE模型大鼠NK细胞有一定的调节作用[8]，EAE小鼠神经功能评分较模型组明显降低，脑组织炎性浸润程度减轻，恢复期NK细胞明显增加[9]。候选核心组分相关靶蛋白PPI网络中IL-6、MMP-9、IL-4、IFN-γ节点度均较高。KEGG代谢通路分析发现，Natural killer cell mediated cytotoxicity是PPI网络的重要通路之一，这与前期研究发现补肾益髓胶囊对NK细胞的调节作用相一致。大量生长因子参与神经系统的修复和再生过程，故筛选出的TGF-β1、血管内皮生长因子（VEGF）A、表皮细胞生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）2相关度均较高。上述研究结果提示补肾益髓胶囊可能通过调节炎症因子、生长因子和细胞免疫功能发挥神经保护作用。
PPI网络中Neuroactive ligand-receptor interaction、 Neurotrophin signaling pathway 2个信号通路与神经系统功能密切相关。通过检索KEGG数据库中的通路信息发现，Neurotrophin signaling pathway包含PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway、p53 signaling pathway、NF-κB signaling pathway等通路的主要功能基因，通过调节细胞凋亡、生长、分化起到促进轴突生长、神经再生的作用。补肾益髓胶囊可明显增加脑源性神经营养因子（BDNF）在EAE小鼠脑内的表达，可能通过促进BDNF表达而起到神经保护作用[10]，BDNF正是Neurotrophin signaling pathway的关键蛋白。另外，与神经功能恢复密切相关的轴突导向通路包含了KEGG富集的MAPK signaling pathway、Wnt signaling pathway等主要功能基因，有利于轴突生长和再生，为神经功能修复提供条件。
在靶点-疾病网络中，靶点peroxisome proliferator activated receptor gamma和Beta-2 adrenergic receptor直接与MS相关。Peroxisome proliferator activated receptor gamma主要通过抑制小胶质细胞和星形胶质细胞活化[11]、保护少突胶质细胞前体细胞[12-13]、抑制中枢神经系统炎症因子分泌[14]等起到神经保护的作用，治疗MS常用的过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂通过NF-κB signaling pathway、Jak-STAT signaling pathway等通路发挥神经调节作用。而Beta-2 adrenergic receptor参与MS的炎性脱髓鞘和轴突变性，在发病过程中起到重要作用。
中药复方并不等同于几味药或几种化合物成分的简单相加，而是一个综合作用体系。目前整体研究处于瓶颈阶段，黑箱理论无法得到更好的研究结果。本研究为理论层面尝试，希望找到可靠途径分解分析大复方。靶点-疾病网络显示不同疾病具有共同的病理变化，可被同一复方治愈，即1个复方可对应多种疾病。将系统药理学方法引入中药配伍分析，能快速确定复方活性成分，揭示药物间的协同互作关系。本研究通过靶点网络分析得出补肾益髓胶囊治疗MS的主要作用机制与多条信号通路均相关，是多因素诱导的综合效应，各信号通路既互相独立，又互相联系，形成复杂的协同效应。上述结果与中医药治疗疾病的整体观念一致。中药是一个多成分的复杂体系，通过网络药理学和生物信息学研究，有助于探讨补肾益髓胶囊治疗MS的作用机制，为后续分子机制研究和实验设计提供依据;通过筛选，可精简复杂中药复方，为新药研发提供参考。
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（收稿日期：2018-09-22）
（修回日期：2019-01-13;編辑：向宇雁）
