杨金伟 赵灿 吴勇军 刘秀 喻嵘
摘要：目的 采用網络药理学方法探讨丹参饮治疗糖尿病心肌病的化学成分、作用靶点及可能作用机制。方法 应用TCM database@Taiwan、Chemistry Database、HIT及Batman-TCM数据库获取丹参饮的化学活性成分及相关靶点信息，通过对比CTD及Gencards数据库，归纳丹参饮化学成分中明确对糖尿病心肌病具有治疗作用的靶基因，构建成分-靶点网络图。综合药物-疾病靶基因，使用String10.5构建靶点相互作用网络，使用Cytoscape3.6.1软件的Network Analyzer工具进行拓扑分析，对丹参饮关键化学成分及靶基因进行评价。通过DAVID6.8数据库对靶点基因功能进行富集分析，通过KEGG通路分析获得参与的相关作用通路。结果 筛选得到丹参饮中91种化学成分和924个靶点对糖尿病心肌病有明确治疗作用，成分-靶点网络图显示成分与疾病靶点可能通过ADH1C、SCN10A、RYR3、MED1、SCN5A等关键基因，经由神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路、cAMP信号通路、胆碱能突触和癌症中的蛋白聚糖等通路发挥治疗作用。结论 丹参饮通过多种药物化学成分及靶点效应有效干预糖尿病心肌病，分析成分、靶点及通路的相互关系可为进一步实验及临床研究提供基础。
关键词：网络药理学;丹参饮;糖尿病心肌病;潜在靶点
中图分类号：R259.872;R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2020）03-0078-06
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201812376
Discussion on Molecular Mechanism of Danshen Decoction on Diabetic Cardiomyopathy based on Network Pharmacology
YANG Jinwei， ZHAO Can， WU Yongjun， LIU Xiu， YU Rong
Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China
Abstract： Objective To explore the chemical components， targets， and potential mechanism of Danshen Decoction in treating of diabetic cardiomyopathy based on network pharmacology. Methods The TCM database@Taiwan， Chemistry Database， HIT and Batman-TCM database were used to obtain information about chemical active components and targets of Danshen Decoction. By comparing the CTD and Gencards databases， the target genes that had a therapeutic effect on diabetic cardiomyopathy in the chemical components of Danshen Decoction were concluded. A component-target network map was constructed， and the core target interaction network was screened. The drug-disease target genes were synthesized， and the String10.5 was used to construct a target interaction network. Network Analyzer tool of Cytoscape3.6.1 software was used for topological analysis to evaluate the key chemical components and target genes of Danshen Decoction. The gene function enrichment was analyzed with DAVID6.8 database， and the relevant metabolic pathways were analyzed through the KEGG pathway analysis. Results Totally 91 chemical components and 924 targets with /confirm/ied therapeutic effect on diabetic cardiomyopathy in Danshen Decoction were obtained after screening. The component-target network map showed that components and disease targets may pass key genes such as ADH1C， SCN10A， RYR3， MED1 and SCN5A， via neuroactive ligand-receptor interactions， calcium signaling pathways， cAMP signaling pathways， cholinergic synapses and proteoglycans in cancer to play an intervention in the treatment of diabetic cardiomyopathy. Conclusion The same and different chemical components and target effects exist between Danshen Decoction effectively interfere with diabetic cardiomyopathy， and analyzing the relationship between components， targets and pathways can provide
a basis for further experiments and clinical applications.
Keywords： network pharmacology; Danshen decoction; diabetic cardiomyopathy; potential targets
糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病并发的特异性心肌病，表现为心肌肥厚、心肌纤维化，进一步影响心肌收缩舒张功能，常并发心力衰竭及心律失常[1]。DCM发生发展过程中存在多因素共同介导，糖脂代谢失衡、氧化应激及炎症反应、心肌细胞的凋亡、心肌纤维化等参与DCM的进程[2-3]。调节血管内环境稳态、改善微循环及保护心肌细胞是治疗关键[4]。中药存在复杂化学架构，多组分、多靶点协同作用，用于DCM辨证治疗具有明显优势。《时方歌括》有“丹参饮，治心痛、胃脘诸痛多效”。丹参饮由丹参、砂仁、檀香3味药组成。大鼠体内实验显示，丹参饮具有保护心肌、维持血管内皮完整抑制血小板聚集、抗炎、抗脂质过氧化和清除自由基等多种药理作用[5]。临床研究表明，丹参饮可缓解DCM患者临床症状，改善心肌细胞功能，提高综合治疗的有效性[6]。通过研究其药效物质基础，发现作用靶点，可进一步阐明其作用机制。网络药理学整合药物、靶点与疾病间相互作用的关联性，从整体视角解析中药与机体之间的作用关系，通过构建成分-靶点-疾病网络图，可系统并可视化多成分与多靶点之间的相互作用[7]。本研究运用网络药理学方法构建丹参饮的主要化学成分-靶点网络，发现药物与疾病对应的作用靶点，明确丹参饮治疗DCM的潜在分子机制，为进一步实验及临床研究提供依据。
1 资料与方法
1.1 化学成分收集
以丹参饮组成药物丹参、砂仁、檀香作为关键词，通过中药化学数据库TCM database@Taiwan（http：// tcm.cmu.edu.tw/）[8]、化学专业数据库Chemistry Database（http：//www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp）及中草药活性成分数据库HIT（http：//lifecenter.sgst.cn/hit/）[9] 收集丹参饮主要化学成分，建立数据集。
1.2 潜在靶点预测
应用Batman-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman- tcm/）分析平臺[10]，在线提交丹参饮各单味药化学成分信息，获得与丹参饮可能作用靶点，以高可信度的蛋白作为靶点提取标准（Prediction Score cutoff>20）。使用UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）中UniProtKB搜索功能，通过输入蛋白名称并限定物种为人，将检索得到的所有靶点校正为其官方名称（official symbol），经上述数据库检索和转化操作，获取与活性成分相关的靶点信息[11]。
1.3 疾病靶点筛选
CTD数据库（http：//ctdbase.org/）提供关于化学-基因/蛋白质相互作用、化学疾病和基因-疾病关系的信息[12]。Gencards数据库（https：//www.genecards.org/）是整合详细的人类基因信息（包括基因组、转录组、蛋白质组学、遗传、临床和功能信息）[13]。以“diabetic cardiomyopathy”为关键词，通过对比CTD、Gencards数据库，归纳对DCM具有治疗作用的靶点。
1.4 成分-靶点网络构建
将上述化学成分和靶点数据信息，剔除无对应靶点的化学成分及重复靶点后，导入Cytoscape3.6.1（https：//cytoscape.org/），构建丹参饮化学成分-靶点网络，并使用String10.5（https：//string-db.org/）构建靶点相互作用网络，对靶点网络进行拓扑分析，探究成分与潜在靶点在其系统层面的复杂关系[14]。
1.5 网络拓扑分析
运用Cytoscape3.6.1软件的Network Analyzer工具进行拓扑分析。通过计算网络中各节点和边的拓扑特征值，包括节点连接度（betweenness centrality）及介度（degree），对丹参饮关键化合物及靶点进行评价。
1.6 基因富集分析
DAVID6.8数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）为大规模的基因或蛋白列表提供系统综合的生物功能注释信息[15]。将筛选得到的干预DCM作用靶点导入DAVID6.8数据库，限定物种为人，对靶点进行基因富集分析，通过KEGG通路分析获得参与的相关通路，从分子生物学角度阐释丹参饮治疗DCM的作用机制。
2 结果与分析
2.1 有效成分及靶点
共筛选得到丹参饮治疗DCM的化学成分91个、靶点924个，其中丹参成分和靶点分别为37、646个，砂仁成分和靶点分别为37、446个，檀香成分和靶点分别为20、513个。
2.2 成分-靶点网络
丹参饮成分-靶点网络见图1，包括2150个节点（94个化合物节点、2056个靶点节点）和5415条边，每条边表示化合物分子与靶点之间的相互作用关系。丹参饮治疗DCM的靶点相互作用网络见图2，包括557 个节点和6488条边，平均節点度为23.3。
注：红色、紫色、黄色节点分别表示丹参饮中丹参、檀香、砂仁的化合物分子，蓝色节点表示药物靶点
图1 丹参饮治疗DCM化学成分-靶点网络
图2 丹参饮治疗DCM靶点相互作用网络
2.3 靶点网络拓扑分析
节点连接度表示网络中与该节点相连路线的条数，连线较多的节点在整个网络中起枢纽作用，可能是关键的化合物或靶点。丹参饮治疗DCM靶点相互作用网络中前15位靶点拓扑属性见表1。前5位靶点为ADH1C、SCN10A、RYR3、MED1、SCN5A，分别与13、12、12、11、11个化合物发生相互作用。
表1 丹参饮治疗DCM靶点拓扑属性分析（前15位）
2.4 靶点基因富集分析
对丹参饮治疗DCM的有效成分靶点进行基因富集分析，结果见表2、图3。丹参饮治疗DCM参与的通路包括神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路、cAMP信号通路、胆碱能突触和癌症中的蛋白聚糖等，表明丹参饮有效成分可能通过作用这些靶点所在的信号通路发挥治疗DCM作用。
表2 丹参饮治疗DCM靶点参与的KEGG通路分析
图3 丹参饮治疗DCM相关靶点-通路
3 讨论
DCM是一种独立于糖尿病大血管并发症的心肌结构和功能改变的疾病，其早期症状隐匿，进展性心肌细胞损害持续存在，后期易致糖尿病患者致命性心力衰竭[16]。心肌细胞凋亡及心肌间质纤维化是DCM发生发展的重要病理改变[17]。DCM病理机制包括糖、血脂代谢异常对心肌细胞损害;细胞内Ca2+稳态失常影响心肌细胞舒张和收缩功能异常;心脏自主神经病变引起心率以及血流动力学发生异常的病理改变;肾素-血管紧张素系统的激活触发心肌肥厚，并导致心功能不全的发生;胰岛素抵抗心肌细胞的糖代谢效率，导致心脏的功能障碍等[18-19]。目前临床对DCM的药物治疗主要以延缓心肌损伤、改善心肌代谢为主，难以修复受损心肌。中药对DCM的早期治疗及患者症状改善有明显优势。丹参饮具有活血祛瘀、理气止痛功效，广泛应用于心血管疾病的治疗。研究表明，丹参饮可通过调节糖脂代谢，下调心肌血小板反应蛋白-1、转化生长因子-β1表达水平，减轻DCM大鼠心肌纤维化，显著延缓高血糖大鼠DCM进程[20]。
本研究通过对丹参饮进行网络药理学分析，对复方中单味药物进行化学成分和相应的靶点基因进行筛选，综合DCM相关靶基因信息，构建了成分-靶点网络。其中丹参平均靶点数目为49个，每个靶点平均与3种化合物相互作用;檀香平均靶点数目为51个，每个靶点平均与3种化合物相互作用;砂仁平均靶点数目为69个，每个靶点平均与4种化合物相互作用。单个化学成分可有多个靶点作用效应，同时，不同化学成分在同一靶点上也有交集，体现了中药作用靶点广泛、途径多样、功能丰富的特点。化合物靶点网络中的关键靶点包括ADH1C、SCN10A、RYR3、MED1、SCN5A。ADH1C是成熟肝细胞所特有的基因表达，可氧化肠道微生物产生内源性乙醇，氧化类固醇和胆汁酸[21]。MED1作为PPARs等核受体和转录因子的激活子，可调控细胞代谢、增殖及分化，在肝脏中亦有明显表达[22]。调节ADH1C表达可促进肝脏糖异生和糖分解平衡，而MED1可提升胰岛素敏感性，使葡萄糖耐受性增加。碳水化合物在体内过程富余时，多余的能量则转化为脂肪酸，以三酰甘油和胆固醇的形式储存于脂肪组织。ADH1C将乳糜颗粒加工成游离的脂肪酸和三酰甘油，促进转运，稳定血脂状态。MED1具有氧化脂肪酸的能力，减少极低密度脂蛋白含量。丹参饮通过调节二者在肝脏中特异性表达，调节糖脂代谢水平，截断DCM进程。人基因组中存在11种编码电压门控钠离子通道（voltage-gated sodium channel，VGSC）α亚单位的基因。SCN5A编码的Nav1.5对心脏组织中的钠离子通道有特异性作用，在心肌细胞及特化的心脏传导系统中均大量表达。SCN10A同样在心脏电生理中有重要作用，与心肌传导系统功能和多种心律失常密切相关[23]。丹参饮可干预SCN5A及SCN10A调节心肌细胞功能状态和电生理过程，达到治疗DCM的效应。丹参饮靶向细胞内钙信号通道基因RyR3，可影响Ca2+信使作用，调节机体神经递质释放、细胞增殖与凋亡，在小肠黏膜上皮细胞中的稳态效应可以促进葡萄糖吸收，维持心肌细胞的正常收缩舒张功能[24]。KEGG通路主要涉及神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路、cAMP信号通路、胆碱能突触和癌症中的蛋白聚糖等，由此推测丹参饮的有效成分可能通过作用于上述信号通路达到治疗DCM的目的。其中神经活性配体-受体相互作用信号通路是质膜上所有与细胞内外信号通路相关的受体配体的集合，与神经功能关系最为密切。电生理活动和机械运动是心脏的基本活动形式，心肌细胞代谢障碍、自主神经功能紊乱、胰岛素抵抗及细胞因子等都参与了DCM的发生发展。在DCM病理状态下，心脏电生理活动出现障碍及紊乱，进而影响心脏的泵血功能，引起血流动力学异常[25]。而心肌细胞外葡萄糖水平升高直接引起钙稳态失调，通过钙信号通路影响胞内钙离子转运，降低肌膜上的Na+-K+-ATP酶及肌浆网Ca2+-ATP酶活性，造成钙离子超载，导致心肌细胞损伤，心肌舒张期延长。细胞胞膜受损，肌动蛋白对外周钙离子浓度敏感性下降，引起心室收缩功能障碍[26]。cAMP是细胞内重要的第二信使，经由PKA磷酸化信号转导途径中靶点调控细胞代谢功能，与血压、心率及心肌收缩等心血管功能密切相关[27]。抑制心肌细胞内cAMP蓄积，可减少心肌耗氧量，缓解过度激素及神经递质释放造成的心肌组织损伤，维持心肌正常不应期状态，防止心率失常的发生。上述研究均佐证了网络药理学分析结果。
本研究基于网络药理学分析药物与疾病靶点的相互作用关系，明确了丹参饮有效成分及其治疗DCM潜在作用靶点，并通过KEGG通路分析阐释其信号通路及分子机制，可为丹参饮干预DCM的临床应用提供依据，为后续机制研究提供思路和方法。
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（收稿日期：2018-12-29）
（修回日期：2019-01-30;編辑：陈静）
