余毅 潘波 杨冬梅 祝家乐 赵洪庆 王芊芊 卢敏 余望贻
摘要：目的 觀察活血化瘀合剂对膝骨性关节炎模型兔炎症因子及TLR4/NF-κB通路的影响，探讨其关节保护作用机制。方法 将新西兰兔分为正常组、假手术组、模型组、中药组和阳性药组，每组8只。采用改良的Hulth造模法建立兔膝骨性关节炎模型，成模后中药组给予活血化瘀合剂（2.6 g/kg）灌胃，阳性药组给予硫酸氨基葡萄糖溶液（15 mg/kg）灌胃，正常组、假手术组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃，每日2次，连续28 d。末次给药后，切除兔右后膝关节软骨用于组织病理分析，分离血清及关节液，检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-6含量，Western blot检测关节软骨Toll样受体4（TLR4）、核因子-κB（NF-κB）蛋白表达。结果 模型组兔关节软骨存在浅表层纤维化，软骨细胞成簇、肥大、排列紊乱、部分坏死，滑膜增厚，基质染色丢失等病理现象，血清和关节液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量较正常组和假手术组均显著升高（P<0.05，P<0.01），软骨TLR4、NF-κB蛋白表达显著升高（P<0.01）;与模型组比较，中药组兔关节软骨病理损伤得以缓解，炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量均不同程度下降（P<0.05，P<0.01），TLR4、NF-κB蛋白表达显著降低（P<0.05，P<0.01）。结论 活血化瘀合剂能缓解膝骨性关节炎模型兔关节软骨的损伤，其机制与抑制TLR4/NF-κB通路、降低炎症因子水平有关。
关键词：膝骨性关节炎;活血化瘀合剂;炎症因子;关节软骨;TLR4/NF-κB通路;兔
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2020）03-0039-04
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201907029
Effects of Huoxue Huayu Mixture on Inflammatory Factors and TLR4/NF-κB Pathway in Rabbit Model of Knee Osteoarthritis
YU Yi， PAN Bo， YANG Dongmei， ZHU Jiale， ZHAO Hongqing， WANG Qianqian， LU Min， YU Wangyi
Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China
Abstract： Objective To observe the effects of Huoxue Huayu Mixture on inflammatory factors and TLR4/NF-κB pathway in rabbit model of knee osteoarthritis; To discuss its protective mechanism for joints. Methods New Zealand rabbits were divided into normal group， sham-operation group， model group， TCM group and positive medicine group， with 8 rats in each group. A rabbit model of knee osteoarthritis was established by modified Hulth modeling method. After successful modeling， TCM group was given Huoxue Huayu Mixture （2.6 g/kg） for gavage， positive medicine group was given glucosamine sulfate solution （15 mg/kg） for gavage， and normal group， sham-operation group and model group were given equal volume of distilled water for gavage， twice a day， for 28 d After the last administration， the right posterior knee articular cartilage was removed for histopathological analysis， and serum and joint fluid were separated to detect the levels of inflammatory factors TNF-α， IL-1β and IL-6. Western blot was used to detect TLR4 and NF-κB protein levels in articular cartilage. Results Rabbits articular cartilage in model group had superficial fibrosis， chondrocyte clustering， hypertrophy， disordered arrangement， partial necrosis， thickening of synovial membrane， loss of matrix staining and other pathological phenomena. The levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 in serum and joint fluid were significantly higher than those in normal group and sham-operation group （P<0.05，
P<0.01）， and the expressions of TLR4 and NF-κB in cartilage increased （P<0.01）. Compared with the model group， the pathological damage of rabbit articular cartilage of TCM group was alleviated， and the levels of TNF-α， IL-1β， and IL-6 decreased to different degrees （P<0.05， P<0.01）. The protein expressions of TLR4 and NF-κB also decreased significantly （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Huoxue Huayu Mixture can alleviate the damage of articular cartilage in rabbit model with knee osteoarthritis， and its mechanism may be related to inhibiting TLR4/NF-κB pathway and reducing the level of inflammatory factors.
Keywords： knee osteoarthritis; Huoxue Huayu Mixture; inflammatory factors; articular cartilage; TLR4/NF-κB pathway; rabbits
膝骨性關节炎是由于膝关节局部损伤、炎症或慢性劳损引起的软骨变性及活动障碍的慢性退行性骨关节病，常见于中老年人，我国55～64岁人群中患病率高达49%[1]。目前，膝骨性关节炎发病机制尚未完全阐明，通常认为炎症因子在其发生发展过程中起到关键作用。炎症因子过度表达能导致骨基质降解酶的大量释放，引起软骨组织损伤[2-3]。TLR4/NF-κB通路作为天然免疫模式识别，介导炎症因子的表达，在多种免疫性疾病的发生发展过程中起着重要作用[4]。活血化瘀合剂由当归、赤芍、姜黄3味中药组成，前期临床研究证实其治疗膝骨性关节炎疗效显著[5]，但作用机制尚不明确。本研究采用新西兰兔建立膝骨性关节炎模型，观察活血化瘀合剂对软骨组织病理形态及炎症因子表达的影响，从免疫相关的TLR4/NF-κB通路着手，明确其治疗膝骨性关节炎的具体分子机制，为其临床应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 动物
42只清洁级健康新西兰兔，5月龄，体质量2.0～2.5 kg，雌雄各半，湖南中医药大学实验动物中心代购，动物许可证号SYXK（湘）2015-0006。饲养于湖南中医药大学实验动物中心，温度（24±2）℃，相对湿度（65±10）%，光照12 h，噪声<60 dB标准环境，自由摄食饮水。
1.2 药物
活血化瘀合剂（当归10 g，赤芍10 g，姜黄10 g），饮片均购自湖南中医药大学第一附属医院，全方煎煮2次，合并煎液，浓缩至含1.3 g原药材/mL，4 ℃冰箱保存备用。硫酸氨基葡萄糖，新兴同仁药业有限公司，批号71610152。
1.3 主要试剂与仪器
肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒（武汉华美生物，CSB-E09315Rb），白细胞介素（IL）-1β试剂盒（武汉华美生物，CSB-E06896Rb）、IL-6试剂盒（武汉华美生物，CSB-E06903Rb），TLR4一抗（美国CST，14358S），核因子-κB（NF-κB）一抗（美国CST，8242S），二抗（武汉博士德，BM3243）。切片机（德国Leica，RM223），倒置光学显微镜（德国Leica，DMi1），凝胶成像仪（德国Bio-Rad，ChemiDoc XRS+），酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific，MK3）。
1.4 分组、造模与给药
将42只新西兰兔随机分为正常组（8只）、假手术组（8只）和造模组（26只）。造模组均采用改良的Hulth造模法建立兔膝骨性关节炎模型[6]。兔耳缘静脉注射20%乌拉坦（4 mL/kg）麻醉，固定，右侧后腿膝关节常规脱毛、消毒，使膝关节屈曲，沿兔膝关节内侧入路，使内侧副韧带及前交叉韧带完全离断。经前抽屉试验、内侧应力试验验证韧带完全离断后，充分冲洗创口，逐层缝合，术后连续3 d注射青霉素。假手术组从膝关节内侧打开关节腔，但不破坏韧带，而后直接缝合伤口，注射青霉素。造模后4周，行右后膝关节X线片证实模型是否成功。选取24只膝骨性关节炎模型兔，分为模型组、中药组、阳性药组，每组8只。中药组给予临床等效剂量活血化瘀合剂（2.6 g/kg），阳性药组给予临床等效剂量硫酸氨基葡萄糖溶液（15 mg/kg），正常组、假手术组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃。给药体积为5 mL/kg，每日2次，连续28 d。末次给药后1 h麻醉，取血，于右后膝后髌上囊处常规脱毛，作长约0.5 cm的纵行切口，用1 mL生理盐水灌洗关节腔3次后，收集关节液，而后切除右后膝关节软骨，置于4%多聚甲醛中固定或保存于液氮中。
1.5 HE染色
取固定的兔关节软骨，常规石蜡包埋后切片，經脱蜡、水化后进行HE染色，脱水、透明、封片，装盒待用。镜下观察、拍照，分析病理损伤情况，进行Mankin评分[7]。
1.6 炎症因子含量检测
收集兔血液或关节液，4 ℃、4000 r/min离心10 min，取上清液。严格按ELISA试剂盒说明书进行操作，检测血清及右膝关节液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量。
1.7 Western blot检测Toll样受体4、核因子-κB蛋白表达
取兔关节软骨组织，匀浆，测定总蛋白含量。制备分离胶和浓缩胶，上样，80 V恒压电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭，裁剪条带，加入稀释后一抗（GAPDH为内参），4 ℃孵育过夜。洗涤条带，加入二抗室温孵育4 h，洗涤，显影。采用Image J成像软件分析条带灰度值，计算蛋白相对表达量。
1.8 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以x（—）±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HE染色结果
正常组兔关节软骨结构清晰，表面光滑完整，细胞排列整齐，基质染色基本均匀;假手术组兔软骨结构基本完整，细胞排列整齐，边缘无缺损，滑膜厚度均匀;模型组兔软骨浅表层纤维化，表面完整性被破坏，软骨细胞成簇、肥大、排列紊乱，部分坏死，滑膜增厚，基质染色丢失;给予活血化瘀合剂或阳性药治疗后，兔关节软骨表层不平整，偶见少量簇集的软骨细胞，无坏死出现，滑膜稍微增厚，基质染色尚可。Mankin评分模型组较正常组和假手术组显著升高，差异有统计学意义（P<0.01），中药组和阳性药组较模型组显著下降，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见图1、表1。
2.2 活血化瘀合剂对模型兔血清及关节液中炎症因子含量的影响
与正常组比较，假手术组兔血清及关节液炎症因子含量无明显变化;与正常组或假手术组比较，模型组兔血清及右膝关节液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量显著升高（P<0.05，P<0.01）;与模型组比较，中药组和阳性药组兔血清及关节液中炎症因子含量明显降低（P<0.05，P<0.01）。结果见表2。
2.3 活血化瘀合剂对模型兔关节软骨Toll样受体4、核因子-κB蛋白表达的影响
正常组与假手术组兔关节软骨TLR4、NF-κB蛋白表达无明显差异;与正常组或假手术组比较，模型组兔关节软骨TLR4、NF-κB蛋白表达明显升高（P<0.01）;与模型组比较，中药组和阳性药组兔关节软骨TLR4、NF-κB蛋白表达明显降低（P<0.05，P<0.01）。结果见图2、表3。
3 讨论
膝骨性关节炎属中医学“痹证”范畴，是由风、寒、湿邪独立或合而入侵致经络闭阻、气血不通而发生。该病多发于中老年人，由于长期劳损、气血不足，累及筋骨关节，致气血不和，瘀血内生，阻塞经络，瘀热互结，故而成痹。《医林改错》明确提出“痹有瘀血”，提示用活血化瘀法治疗痹证。课题组前期运用活血化瘀法治疗膝骨性关节炎亦取得良好疗效，其中由当归、赤芍、姜黄组成的活血化瘀合剂治疗瘀阻脉络、气滞血瘀型关节炎疗效尤为显著。当归、赤芍、姜黄三药均有活血化瘀功效，不同程度地改善血液流变的性质，减轻关节内压及骨内压，减轻炎症引起的关节液渗出及组织水肿，促进关节软骨基质合成并加速关节损伤的修复。三药合用，达到祛瘀生新功效。
膝骨性关节炎关键病理特征之一是软骨细胞大量降解，而关节软骨主要由细胞外基质组成，抑制基质降解和软骨细胞凋亡被认为是治疗膝骨性关节炎的关键[8-9]。研究表明，炎症因子聚积能引发炎症反应，进而导致骨基质降解酶的大量释放，促进基质降解，同时促进软骨细胞终末分化，诱导细胞功能丧失[10]。TNF-α和IL-6被认为是膝骨性关节炎早期发生发展过程中的关键炎症因子，直接参与关节炎的发生;IL-1β也参与了该疾病的发生，通过增加滑膜液中TNF-α、IL-6的浓度而促进骨基质降解酶的释放及软骨细胞终末化。TLR4/NF-κB信号通路参与调控上述关节炎症反应。TLR4是一种模式识别受体，识别包括脂多糖在内的多种配体，当与相应配体结合后，招募下游信号分子触发一系列的信号级联反应，最终活化NF-κB，从而促进炎症因子基因表达的激活、炎症因子产生和释放。因而，抑制TLR4/NF-κB信号通路能降低炎症因子的释出，缓解膝骨性关节炎病理症状。
本研究中，膝骨性关节炎模型兔关节软骨病理损伤明显，软骨细胞成簇肥大、排列紊乱，部分细胞凋亡甚至坏死，滑膜增厚，炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量显著升高，TLR4/NF-κB通路活化明显，与文献[11]结果一致;经活血化瘀合剂治疗后，模型兔TLR4/NF-κB信号受到抑制，炎症因子水平降低，关节软骨病理损伤状况得以缓解。本研究明确了活血化瘀合剂通过调控TLR4/NF-κB通路，降低炎症因子水平，发挥治疗膝骨性关节炎功效，从炎症因子角度明确活血化瘀合剂的作用环节及靶点，今后拟进行更广泛的作用机制研究。
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（收稿日期：2019-07-02）
（修回日期：2019-08-15;编辑：华强）
