蔡玉+刁海丹
[摘要]目的 研究轉化生长因子-β1（TGF-β1）及其抑制剂Decorin对子宫内膜癌细胞迁移、侵袭转移能力的影响。方法 将子宫内膜癌细胞HEC-1B进行体外培养，实验设阴性对照组（未经TGF-β1及Decorin处理）、TGF-β1组（TGF-β1的处理浓度为10 ng/ml）、Decorin 组（Decorin的处理浓度为100 ng/ml）、TGF-β1及Decorin组（TGF-β1的处理浓度为10 ng/ml，Decorin的处理浓度为100 ng/ml），TGF-β1及Decorin分别作用于人子宫内膜癌细胞HEC-1B后，MTT法检测其对子宫内膜癌细胞的增殖抑制作用。Transwell实验检测TGF-β1及Decorin对子宫内膜癌细胞迁移、侵袭转移能力的影响。结果 Decorin明显抑制子宫内膜癌HEC-1B细胞的体外增殖，与阴性对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。与阴性对照组HEC-1B细胞的迁移数和侵袭数比较，TGF-β1组明显更高（P<0.01），TGF-β1及Decorin组细胞的迁移数和侵袭数略高（P>0.05） ，而TGF-β1及Decorin组HEC-1B细胞的迁移数和侵袭数较TGF-β1组明显减少（P<0.05）。结论 体外TGF-β1能够增强子宫内膜癌细胞HEC-1B的迁移、侵袭转移能力，而TGF-β1抑制剂Decorin可抑制子宫内膜癌细胞的增殖和侵袭转移。
[关键词]子宫内膜癌；侵袭转移能力；TGF-β1；核心蛋白聚糖
[中图分类号] R737.33 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）09（b）-0004-04
The influence of TGF-β1 inhibitor-Decorin on the invasion and migration ability of HEC-1B for endometrial cancer cell
CAI Yu DIAO Hai-dan
Department of Gynecology，the Third People′s Hospital of Dalian City in Liaoning Province，Dalian 116033，China
[Abstract] Objective To study the influence of TGF-β1 inhibitor Decorin on the invasion and migration ability of HEC-1B for endometrial cancer cell.Methods Endometrial cancer cell HEC-1B was cultured in vitro.Negative control group （without TGF-β1 and Decorin treatment） ，TGF-β1 group （10 ng/ml of treatment concentration for TGF-β1） and Decorin group （100 ng/ml of treatment concentration for Decorin），TGF-β1 and Decorin group （treatment concentration of TGF-β1 was 10 ng/ml，Decorin treatment concentration of Decorin was 100 ng/ml） were established.After TGF-β1 and Decorin actting on endometrial cancer cell HEC-1B respectively，MTT method was used to detect the proliferation and inhibition role of TGF-β1 and Decorin on endometrial cancer cell HEC-1B.The influence of TGF-β1 and Decorin on the invasion and migration ability of HEC-1B for endometrial cancer cell was examined by Transwell experimention.Results Decorin inhibited obviously the proliferation in vitro endometrial cancer cell HEC-1B and there was a statistical difference compared with negative control group （P<0.05）.Compared with migration number and invasion number of HEC-1B cell in negative control group，it was obviously higher in TGF-β1 group （P<0.01） and it was slightly higher in TGF-β1 and Decorin group （P>0.05），and the migration number and invasion number of HEC-1B cell in TGFβ1 and Decorin group was obviously reduced compared with TGF-β1 group （P<0.05）.Conclusion TGF-β1 in vitro can enhance the invasion and migration ability of endometrial cancer cell HEC-1B，while TGF-β1 inhibitor—Decorin can inhibit the proliferation and invasion and migration of endometrial carcinoma cell.endprint
[Key words]Endometrial cancer；Invasion and migration ability；Transforming growth factor-β1；Decorin
子宫内膜癌是女性生殖器官最常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率呈明显上升趋势[1-2]。局部复发及远处转移是子宫内膜癌预后的关键步骤[3]。近年研究发现[4-5]，上皮-间质转化（epithelial to mensenchymal transition，EMT）是上皮性癌侵袭转移的重要机制，通过下调上皮黏附分子的表达使细胞间接触力降低同时细胞流动性增强，从而使恶性细胞得以向远处播散。EMT的发生是一个复杂的过程，其中包括多条信号通路，其中最主要的是转化生长因子-β1（TGF-β1）信号通路[6]。已经证实，TGF-β1在体内、外培养的大多数上皮细胞、上皮来源的肿瘤细胞中均具有诱导EMT的作用[7-9]。近20年来的研究数据说明核心蛋白聚糖（Decorin）是TGF-β1的天然抑制剂，可抑制多种肿瘤细胞的生长及侵袭[10]，但Decorin能否抑制子宫内膜癌细胞的生长及侵袭，目前尚无报道。本研究拟检测 TGF-β1抑制剂Decorin 对子宫内膜癌HEC-1B细胞迁移、侵袭转移能力的影响，为子宫内膜癌治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
人子宫内膜癌细胞株HEC-1B购自中科院上海细胞库。TGF-β1购自PeproTech公司，重组人核心蛋白聚糖Decorin购自R&D公司，胰蛋白酶购自Gibco公司，DMEM/F12培养基、胎牛血清（FBS）购自美国Hyclone公司。Transwell小室购自Corning公司，人工基底膜基质凝胶（Matrigel）购自BD公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 HEC-1B细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的DMEM/F12培养液中，于37℃、5%CO2培养箱中培养，每48小时换液1次，0.25%胰蛋白酶消化传代。倒置显微镜下观察细胞的生长及形态的变化。细胞呈单层贴壁生长，选用对数生长期细胞进行实验。
1.2.2 实验分组 取对数生长期HEC-1B细胞，每种细胞均设4组：阴性对照组（未经TGF-β1及Decorin处理）、TGF-β1组（TGF-β1的终处理浓度为10 ng/ml）、Decorin组（Decorin的终处理浓度为100 ng/ml）、TGF-β1和Decorin组（终处理浓度分别为10、100 ng/ml），置37℃、5%CO2培养箱内继续培养，24 h后换液，48 h后终止培养，收集细胞。
1.2.3 MTT法检测细胞增殖抑制能力 取5×104/ml的HEC-1B细胞接种于96孔培养板，每孔100 μl，每孔细胞数约为5×103个，置37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，后分为4组，分别加入TGF-β1及 Decorin，继续培养48 h。终止培养前加MTT（5 g/L），每孔20 μl，37℃再培养4 h，吸出上清液，加DMSO 150 μl/孔，低速振荡至紫色结晶完全消失，然后在酶标仪上490 nm处测定吸光度值。按下列公式计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率（%）=[1-（实验组A值-空白对照孔A值）/（阴性对照组A值-空白对照孔A值）]×100%。实验重复3次。未接种细胞，只含5%胎牛血清的DMEM/F12培养基、MTT和DMSO的溶剂对照组为空白对照孔。
1.2.4 细胞迁移实验和侵袭实验 取阴性对照组、TGF-β1组，TGF-β1和Decorin组作用24 h后细胞，PBS洗涤细胞，加入0.25%胰酶消化细胞，予含0.1%胎牛血清的培养基重悬细胞，制备单细胞悬液。
1.2.4.1 细胞迁移实验 Transwell上室加入上述各组100 μl细胞悬液，细胞密度为1×105/ml，下室加入600 μl含10%胎牛血清的完全培养基。于37℃、5%CO2培养箱中继续培养24 h后，取出小室，擦去上室内侧面未迁移细胞，用甲醇固定20 min，室溫下0.1%结晶紫染色25 min，于显微镜下每个小室随意选取5个视野进行细胞计数，求平均值。每组实验重复3次。
1.2.4.2 细胞侵袭实验 将无血清培养基和Matrigel按照8∶1稀释，取50 μl稀释的Matrigel铺在Transwell小室的上室内，涂匀，放入37℃、5%CO2培养箱中2 h，吸净未干的Matrigel。之后的步骤同细胞迁移实验。在显微镜下取5个视野进行细胞计数后取平均值，得出每个视野的侵袭细胞数。每组实验重复3次。
1.3 统计学处理
采用统计学软件SPSS 16.0分析数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 各组子宫内膜癌细胞HEC-1B的增殖能力的比较
以终浓度分别为0、10 ng/ml TGF-β1，100 ng/ml Decorin、10 ng/ml TGF-β1+100 ng/ml Decorin分别作用于HEC-1B细胞48 h，MTT检测细胞增殖/活力。结果显示，100 ng/ml Decorin作用后细胞活力/活细胞数有所下降，与阴性对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）（表1），提示Decorin能明显抑制HEC-1B细胞增殖。
2.2 各组子宫内膜癌细胞HEC-1B迁移、侵袭能力的比较
与阴性对照组的HEC-1B细胞迁移数[（84.4±3.48）/HP]比较，TGF-β1组的HEC-1B细胞迁移数[（109±7.54）/HP]明显更高，差异有统计学意义（P<0.05），TGF-β1+Decorin组[（91.4±8.21）/HP]略高（P>0.05），而TGF-β1+Decorin组的细胞迁移数明显低于TGF-β1组，差异有统计学意义（P<0.05）。endprint
与阴性对照组的HEC-1B细胞侵袭数[（29.8±6.89）/HP]比较，TGF-β1组的HEC-1B细胞侵袭数[（65.2±5.23）/HP]明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）， TGF-β1+Decorin组[（38.6±9.31）/HP]略高（P>0.05），而TGF-β1+Decorin组的细胞侵袭数明显低于TGF-β1组，差异有统计学意义（P<0.05）。
3讨论
在肿瘤的复发及转移过程中，多种细胞因子参与并起重要作用。近年来越来越多的研究表明，EMT使肿瘤细胞间黏附性减弱，运动能力增强，在一系列信号分子的调控下，帮助细胞向周围组织渗入或向远处转移。EMT指具有极性及紧密黏附力的上皮细胞转化为无极性、流动性强的间质细胞的病理生理过程，主要表现为上皮细胞的极性丧失及间质细胞迁移能力获得，是肿瘤细胞远处转移的关键环节[11]。TGF-β信号通路、Wnt信号通路、Hh途径、Notch信号途径、核因子（NF）-κB等途径参与EMT的调控[12-13]。TGF-β是一种多功能的细胞因子，与恶性肿瘤细胞的侵袭、转移关系密切，参与多种恶性肿瘤转移过程[14-16]。Miettinen等最早发现，TGF-β能诱导正常的乳腺上皮细胞发生EMT，获得类似成纤维细胞的形态。张琳等[7]的研究发现在乳腺癌中，5 μg/L TGF-β1作用乳腺癌细胞72 h后，可诱导EMT。李鹏等[8]的研究发现，用10 ng/ml TGF-β处理Ishikawa和HEC-1A细胞48 h后，采用蛋白印迹法检测EMT相关标志蛋白E-cad、N-cad、Vim蛋白的表达，结果发现，两种细胞中上皮生物标志物钙粘蛋白（E-cad）表达水平均下降，间质生物标志物神经钙粘蛋白（N-cad）、波形蛋白（Vim）表达水平均升高，提示在ER阳性的Ishikawa细胞和ER阴性的HEC-1A细胞中，TGF-β均能诱发EMT。解刚强等[9]采用外源性人重组TGF-β1及其受体拮抗剂LY2109761作用于人胃癌細胞株SGC7901，显示TGF-β1可诱导胃癌细胞发生EMT，增强其侵袭能力，这种作用可被其受体拮抗剂LY2109761所抑制。本研究采用10 ng/ml TGF-β1作用于HEC-1B细胞24 h，Transwell实验显示，TGF-β1组穿膜细胞数较对照组明显增多（P<0.05），提示TGF-β1可明显增强HEC-1B细胞的迁移侵袭能力，与上述研究结果一致。
Decorin是一种广泛分布于人体组织中的小分子蛋白多糖，是细胞外基质的重要组成部分。目前研究发现DCN 基因是一种抑癌基因，具有抑制实体肿瘤生长或转移的能力[10，17]。其抗肿瘤机制尚未明确，研究显示Decorin是具有TGF-β活性的天然负反馈调节因子，Decorin可通过抑制TGF-β细胞通路作用，并诱导肿瘤细胞自噬，进而抑制神经胶质瘤细胞U87MG的侵袭及转移[18]，亦可通过稳定和提高E-cad蛋白的表达水平抑制结肠癌的生长和转移[19]。Goldoni等[20]发现，Decorin 可有效抑制乳腺癌细胞在原发灶的生长和远处转移，提出Decorin 可作为乳腺癌靶向治疗的候选药物之一。Decorin能否阻断TGF-β诱导子宫内膜癌的EMT，目前尚无研究。本研究用100 ng/ml Decorin作用于人子宫内膜腺癌HEC-1B 细胞系，观察其对细胞增殖及侵袭力的影响。本实验MTT结果提示，该浓度Decorin作用HEC-1B细胞48 h后，抑制率为11.1%。本文进一步研究显示，分别用Decorin和TGF-β1作用于HEC-1B细胞24 h后，TGF-β1组穿膜细胞数较对照组明显增多（P<0.05），Decorin和TGF-β1联合用药组穿膜细胞数较对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），Decorin和TGF-β1联合用药组与TGF-β1组比较穿膜细胞数明显较少，两组差异有统计学意义。上述数据表明，应用TGF-β1抑制剂Decorin后，HEC-1B细胞的细胞增殖率、迁移数及侵袭数均明显下降，提示Decorin通过对TGF-β1的拮抗作用，降低了TGF-β1增强的侵袭能力，抑制了HEC-1B细胞的生长、迁移和侵袭。
本实验证实Decorin能抑制人子宫内膜癌细胞的增殖，并可降低子宫内膜癌细胞的侵袭转移能力。Decorin具体以何种机制抑制肿瘤细胞增殖及转移，将是下一步的研究方向。
[参考文献]
[1]Ueda SM，Kapp DS，Cheung MK，et al.Trends in demographic and clinical characteristics in women diagnosed with corpus cancer and their potential impact on the increasing number of deaths[J].Am J Obstet Gynecol，2008，198（2）：1-6.
[2]Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2013[J].CA C ancer J Clin，2013，63（1）：11-30.
[3]Tsukamoto H，Shibata K，Kajiyama H，et al.Irradiation-induced epithelial-mesenchymal transition （EMT） related to invasive potential in endometrial carcinoma cells[J].Gynecol Oncol，2007， 107 （3）：500-504.
[4]Miealizzi DS，Farabaugh SM，Ford HL.Epithelial-mesenchymal transition in cancer：parallels between normal development and tumor progression[J].J Mammary Gland Biol Neoplasia，2010，15（2）：117-134.endprint
[5]Hayashida T，Jinno H，Kitagawa Y，et al.Cooperation of cancer stem cell properties and epithelial-mesenchymal transition in the establishment of breast cancer metastasis[J].J Oncol，201l，2011：591427.
[6]Wendt MK，Allington TM，Schiemann WP.Mechanisms of the epithelial-mesenchymal transition by TGF-beta[J].Future Oncol，2009，5（8）：1145-1168.
[7]張琳，吕志栋，刘相平，等.转化生长因子-β1通过诱导上皮-间充质转化促进乳腺癌细胞侵袭转移的研究[J].中华实验外科杂志，2015，32（5）：970-982.
[8]李鹏，王志启，赵丽，等.转化生长因子β诱导子宫内膜癌细胞发生上皮间质转化的研究[J].中华妇产科杂志，2014， 49（8）：628-630.
[9]解刚强，刘德纯，邓淼，等. 转化生长因子-β1受体拮抗LY2109761抑制胃癌侵袭转移的机制[J].中华实验外科杂志，2013，30（7）：1459-1461.
[10]Jrvinen TA ，Prince S. Decorin：a growth factor antagonist for tumor growth inhibition[J]. Biomed Res Int，2015，2015：654765.
[11]Padua D，Zhang XH，Wang Q，et al.TGFbeta primes breast tumors for lung metastasis seeding though angiopoietin-like[J].Cell，2008，133（1）： 66-77.
[12]朱蕾，隋华，邓皖利.信号通路调控上皮间质转化参与肿瘤侵袭转移的分子机制[J].国际肿瘤学杂志，2014，41（3）：172-177.
[13]Yang J，Weinberg RA.Epithelial-mesenchymal transition：at the crossroads of development and tumor metastasis[J].Dev Cell，2008，14（6）：818-829.
[14]唐乃玲，郭志，杨雪玲.转化生长因子-β与肿瘤[J].国际肿瘤学杂志，2015，42（1）：43-45.
[15]刘墨，张斌，王成，等.转化生长因子β1诱导人舌鳞状细胞癌细胞上皮-间质转化及其顺铂耐药性研究[J].中华口腔医学研究杂志：电子版，2012，6（3）：5-9.
[16]张红燕，孙洋，李珊珊，等.TGF-β1引发的上皮-间质转化与食管鳞癌浸润转移的关系[J].世界华人消化杂志，2008，16（28）：3162-3166.
[17]Neill T，Schaefer L，Iozzo RV.Decorin as a multivalent therapeutic agent against cancer[J].Adv Drug Deliv Rev，2016， 97：174-185.
[18]Yao T，Zhang CG，Gong MT，et al.Decorin-mediated inhibition of the migration of U87MG glioma cells involves activation of autophagy and suppression of TGF-β signaling[J].Febs Open Bio，2016，6（7）：707-719.
[19]Bi X，Pohl NM，Qian Z，et al.Decorin-mediated inhibition of color-ectal cancer growth and migration is associated with E-cadherin in vitro and in mice[J].Carcinogenesis，2012，33（2）：326-330.
[20]Goldoni S，Seidler DG，Heath J，et al.An antimetastatic role for decorin in breast cancer[J].Am J Pathol，2008，173 （3）：844-855.
（收稿日期：2017-08-09 本文编辑：许俊琴）endprint
