周飞燕+孔雯雯+杨丽菲
[摘要]目的 建立注射用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）冻干粉针剂中主要活性成分的HPLC的测定方法。方法 HPLC色谱条件中，色谱柱为TSK gel G3000SW（300.0 mm×7.5 mm，5 μm），流动相为0.1 mol/L磷酸盐缓冲液，流速为1 ml/min，自动进样20～40 μl，检测波长为280 nm。研究该色谱条件是否能分析rhGM-CSF冻干粉针剂中的各组分、实验重现性以及不同进样体积与各组分峰面积的线性关系。结果 检测出rhGM-CSF冻干粉针剂中的主成分为rhGM-CSF蛋白和人血白蛋白，rhGM-CSF蛋白进样量与峰面积呈良好线性关系，R2>0.99，百分含量的RSD值均<3%。结论 该法可用于检测rhGM-CSF冻干粉针剂蛋白量在10～20 μg范围内的的活性成分含量。
[关键词]重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；冻干粉针剂；高效液相色谱法
[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）05（c）-0104-04
[Abstract]Objective To establish the method of the main active ingredients in recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor freeze-dried powder injection （rhGM-CSF） by HPLC.Methods The chromatographic condition of HPLC was chromatographic column （TSK gel G3000SW，300.0 mm×7.5 mm，5 μm），Mobile phase was 0.1 mol/L phosphate buffer，Flow rate was 1 ml / min，automatic sampling was 20-40 μl and detection wavelength was 280 nm.Analyzing the ingredients of rhGM-CSF freeze dried powder injection，reproducibility and linear relationship between different sample volume and peak area of each component under this chromatographic condition were studied in this experiment.Results The main components of rhGM-CSF freeze dried powder injection were rhGM-CSF protein and human albumin.The rhGM-CSF protein sample volume and peak area were good linear （R2>0.99） and the percentage content of RSD values was less than 3%.Conclusion This method could be used to detect the active component content of the rhGM-CSF lyophilized powder for injection protein with 10-20 μg scope.
[Key words]Recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor；Freeze-dried powder injection；High performance liquid chromatography
重組人粒细胞巨噬细胞刺激因子冻干粉针剂（rhGM-CSF）是使用重组基因工程技术生产的重组蛋白药物[1]343-344，是一种细胞因子，主要用于治疗因放、化疗引起的白细胞减少[2-5]，并且临床上可以治疗溃疡、烫伤、烧伤等创面疾病[6-9]，其活性成分为重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子，该品种已被《中国药典》三部收载[1]343-344。《中国药典》未规定其成品的含量测定方法，只要求测定生物学活性（效价），采用的是TF-1依赖细胞株，用MTT染色法进行测定，合格范围是标示活性的80%～150%[10]96-98，277-279。由于活性测定方法本身的稳定性较差，难以实现精确的控制，因此，为更好地控制产品质量，宜尽早建立其主药成分含量测定方法。
高效液相色谱法（HPLC）中收载rhGM-CSF原液纯度的检测方法，是采用凝胶色谱柱为固定相，磷酸盐缓冲液为流动相，在波长280 nm处进行检测，使用面积归一化法计算目的蛋白百分比含量[10]59-63。目前，高效液相用于药品的定性、定量的分析应用已经很广泛[11-15]，但是用于检测rhGM-CSF冻干粉针剂主药含量的方法尚罕见报道，故本研究通过参考药典中rhGM-CSF原液纯度检测的方法，确认该法检测rhGM-CSF冻干粉针剂主药含量的可行性。
1材料与试药
1.1仪器
Agilent 1100高效液相色谱仪（配有G1315B DAD 检测器、G1311A四元梯度泵、G1322A在线脱气装置、G1316A柱温箱，德国安捷伦科技有限公司）；化学工作站（ChemStation，版本号：Rev.A.10.01[1635]，美国安捷伦科技有限公司）；BS124S型电子天平（德国赛多利斯科学仪器有限公司）；TSK gel G3000 SWXL色谱柱（7.8 mm×300 mm，粒径5 μm，日本东曹株式会社公司）。
[摘要]目的 建立注射用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）冻干粉针剂中主要活性成分的HPLC的测定方法。方法 HPLC色谱条件中，色谱柱为TSK gel G3000SW（300.0 mm×7.5 mm，5 μm），流动相为0.1 mol/L磷酸盐缓冲液，流速为1 ml/min，自动进样20～40 μl，检测波长为280 nm。研究该色谱条件是否能分析rhGM-CSF冻干粉针剂中的各组分、实验重现性以及不同进样体积与各组分峰面积的线性关系。结果 检测出rhGM-CSF冻干粉针剂中的主成分为rhGM-CSF蛋白和人血白蛋白，rhGM-CSF蛋白进样量与峰面积呈良好线性关系，R2>0.99，百分含量的RSD值均<3%。结论 该法可用于检测rhGM-CSF冻干粉针剂蛋白量在10～20 μg范围内的的活性成分含量。
[关键词]重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；冻干粉针剂；高效液相色谱法
[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）05（c）-0104-04
[Abstract]Objective To establish the method of the main active ingredients in recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor freeze-dried powder injection （rhGM-CSF） by HPLC.Methods The chromatographic condition of HPLC was chromatographic column （TSK gel G3000SW，300.0 mm×7.5 mm，5 μm），Mobile phase was 0.1 mol/L phosphate buffer，Flow rate was 1 ml / min，automatic sampling was 20-40 μl and detection wavelength was 280 nm.Analyzing the ingredients of rhGM-CSF freeze dried powder injection，reproducibility and linear relationship between different sample volume and peak area of each component under this chromatographic condition were studied in this experiment.Results The main components of rhGM-CSF freeze dried powder injection were rhGM-CSF protein and human albumin.The rhGM-CSF protein sample volume and peak area were good linear （R2>0.99） and the percentage content of RSD values was less than 3%.Conclusion This method could be used to detect the active component content of the rhGM-CSF lyophilized powder for injection protein with 10-20 μg scope.
[Key words]Recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor；Freeze-dried powder injection；High performance liquid chromatography
重組人粒细胞巨噬细胞刺激因子冻干粉针剂（rhGM-CSF）是使用重组基因工程技术生产的重组蛋白药物[1]343-344，是一种细胞因子，主要用于治疗因放、化疗引起的白细胞减少[2-5]，并且临床上可以治疗溃疡、烫伤、烧伤等创面疾病[6-9]，其活性成分为重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子，该品种已被《中国药典》三部收载[1]343-344。《中国药典》未规定其成品的含量测定方法，只要求测定生物学活性（效价），采用的是TF-1依赖细胞株，用MTT染色法进行测定，合格范围是标示活性的80%～150%[10]96-98，277-279。由于活性测定方法本身的稳定性较差，难以实现精确的控制，因此，为更好地控制产品质量，宜尽早建立其主药成分含量测定方法。
高效液相色谱法（HPLC）中收载rhGM-CSF原液纯度的检测方法，是采用凝胶色谱柱为固定相，磷酸盐缓冲液为流动相，在波长280 nm处进行检测，使用面积归一化法计算目的蛋白百分比含量[10]59-63。目前，高效液相用于药品的定性、定量的分析应用已经很广泛[11-15]，但是用于检测rhGM-CSF冻干粉针剂主药含量的方法尚罕见报道，故本研究通过参考药典中rhGM-CSF原液纯度检测的方法，确认该法检测rhGM-CSF冻干粉针剂主药含量的可行性。
1材料与试药
1.1仪器
Agilent 1100高效液相色谱仪（配有G1315B DAD 检测器、G1311A四元梯度泵、G1322A在线脱气装置、G1316A柱温箱，德国安捷伦科技有限公司）；化学工作站（ChemStation，版本号：Rev.A.10.01[1635]，美国安捷伦科技有限公司）；BS124S型电子天平（德国赛多利斯科学仪器有限公司）；TSK gel G3000 SWXL色谱柱（7.8 mm×300 mm，粒径5 μm，日本东曹株式会社公司）。
3.2 HPLC检测法对混合组分的适用性
本文采用HPLC法对rhGM-CSF 冻干粉针剂及其单组分进行检测，结果表明，该法可检测出rhGM-CSF冻干粉针剂中的主成分rhGM-CSF蛋白和人血白蛋白，各峰之间的分离度较好；HPLC方法的重现性较好，相同进样体积条件下，其峰面积及峰面积百分比的RSD均<1%；不同进样量（20～40 μl）与各组分的峰面积显示明显线性关系，R2均>0.99，故该法可用于检测rhGM-CSF冻干粉针剂中的活性成分的含量百分比。另外，由于不同样品的峰面积与其进样量呈一定的线性关系，还可在一定范围内根据rhGM-CSF蛋白峰面积的变化，推测其对应的含量。
应用HPLC法检测rhGM-CSF冻干粉针剂中rhGM-CSF含量，是原液评价的一种直观、合理、有效的技术手段，具有重现性好和操作简便等优点，能很好地满足质控的要求，对完善该品种的质量标准提供了参考。
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（收稿日期：2017-03-16 本文编辑：祁海文）
