李萍 宋娟 李清漪 张奇 崔红霞 关宝生 赵玉杰 宋志斌
[摘要]目的 探讨玉米须黄酮提取物对改良痛风性关节炎模型大鼠的疗效。方法 选取56只Wistar大鼠，将其随机分为空白对照组，模型组，秋水仙碱组，苯溴马隆组，玉米须黄酮提取物高、中、低剂量组，每组8只，建立改良急性痛风性关节炎大鼠模型并给予相应药物干预，于踝关节造模后12、24、36、48 h测量各组大鼠右侧踝关节周长并计算肿胀度；给药7 d后检测各组大鼠血清中白细胞介素-1β（IL-1β）和尿酸（UA）水平。结果 模型组在各时间节点的关节肿胀度均高于空白对照组（P<0.01）。与模型组比较，在踝关节造模24 h后，秋水仙碱组，黄酮提取物高、中剂量组的踝关节肿胀度均低于模型组（P<0.05）。给药7 d后，模型组大鼠血清IL-1β和UA水平显著高于空白对照组（P<0.01），黄酮提取物高、中剂量组及秋水仙碱组大鼠血清IL-1β表达水平均低于模型组（P<0.05）；黄酮提取物高、中剂量组及苯溴马隆组大鼠血清UA水平均低于模型组（P<0.01）。结论 玉米须黄酮提取物可能通过抑制炎性细胞因子IL-1β的表达缓解急性痛风性关节炎的急性炎症反应，降低UA水平。
[关键词]急性痛风性关节炎；黄酮；玉米须；白细胞介素-1β；尿酸
[中图分类号] R965.3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）12（a）-0008-04
急性痛风性关节炎（acute gouty arthritis，AGA）是一组由嘌呤代谢紊乱，尿酸产生增多和（或）尿酸排泄减少，导致单钠尿酸盐（monosodium urate，MSU）晶体沉积在关节腔、滑膜囊、软骨等软组织引起的无菌性急性炎症反应，是痛风典型的临床表现[1-3]。其全球发病率呈逐年上升趋势，严重危害人类健康。现临床治疗AGA多以西药为主，起效虽快，但对胃肠功能、肝肾功能、骨髓造血功能等存在严重损害[4-6]。因此，越来越多的抗痛风天然药物研究引起人们关注，且其疗效和副作用在一定程度上得到证实。
玉米须（Stigma Maydis）为禾本科植物玉米的雌花花柱，最早记载于《滇南本草》，是《中华人民共和国卫生部药材标准》1985版（一部）收录的常用药材品种，含有多聚戊糖、黄酮类、挥发油、皂普、生物碱等多种活性成分，有显著的利尿、降血糖、抑菌、降压、增强免疫、抗癌等功效[3]。其中黄酮类化合物有抑菌、抗炎、抗癌、抗氧化、抗疲劳、降血糖、降血脂等作用[4-5]。本研究在建立氧嗪酸钾和MSU联合诱导的大鼠改良GA模型的基础上，探究玉米须黄酮提取物对改良AGA模型大鼠的影响及可能作用机制，为抗痛风天然藥物的研发提供参考。
1材料与方法
1.1实验动物
选取Wistar雄性大鼠，体重180～220 g，动物使用许可证号：SYXK（黑）2016-001。购自哈尔滨医科大学动物实验中心。饲养条件：室温20～25℃，湿度40%～50%，自然昼夜节律，定期更换垫料。
1.2试剂与仪器
玉米须黄酮提取物（黄酮类化合物含量20%，哈尔滨赛百奥科技有限公司）；氧嗪酸钾（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；MSU晶体（美国Sigma公司）；秋水仙碱片（西双版纳版纳药业有限责任公司）；大鼠白细胞介素-1β（IL-1β）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒（武汉基因美科技有限公司）；尿酸试剂盒（南京建成生物工程研究所）；酶标仪（Lay systems Multiskan Ascent）。
1.3实验方法
1.3.1分组及给药 选取56只Wistar大鼠，随机分为7组，分别为空白对照组，模型对照组，秋水仙碱组，苯溴马隆组，玉米须黄酮提取物高、中、低剂量组。动物适应性饲养1周后，秋水仙碱组给予秋水仙碱0.9 mg/100 g，苯溴马隆组给予苯溴马隆1 mg/100 g，玉米须黄酮提取物高、中、低剂量组分别给予0.5、0.25、0.125 g/100 g，空白对照组和模型组给予等体积蒸馏水，每日上午9：00灌胃给药，1次/d，连续给药7 d。
1.3.2动物模型的建立 参照吕军等[10]建立的高尿酸血症并AGA大鼠模型进行造模。空白对照组：每日上午8：00和晚上20：00腹腔注射生理盐水1 ml/100 g，2次/d，连续注射7 d，期间于第5天上午10：00，用6号注射针在大鼠右侧踝关节后侧沿跟腱内侧以30°～40°方向进针，将0.2 ml生理盐水注入关节腔中。模型对照组、秋水仙碱组、苯溴马隆组、玉米须黄酮提取物高、中、低剂量组：每日上午8：00和晚上20：00腹腔注射3%氧嗪酸钾1 ml/100g，2次/d，连续注射7 d，期间于第5天上午10：00，用6号注射针在大鼠右侧踝关节后侧沿跟腱内侧以30°～40°方向进针，将0.2 ml尿酸钠（25 mg/ml）注入关节腔中。
1.4检测指标及方法
1.4.1一般情况 实验过程中，观察并记录各组大鼠食量、饮水、大小便、体重、毛发、精神状态等变化。
1.4.2踝关节肿胀度检查 用记号笔标记各组大鼠右侧踝关节受试部位，确定每次测量位置一致。采用缚线法测量各组大鼠右侧踝关节原始周长，在踝关节造模后12、24、36、48 h分别测定踝关节周长。计算关节肿胀度=（测定周长-原始周长）/原始周长×100%。
1.4.3血清尿酸和IL-1β检测 第7天给药后1 h各组大鼠内眦采血（采血前禁水、禁食12 h），静置，以3000 r/min离心10 min，分离血清于EP管，采用酶比色法检测尿酸含量，采用ELISA法检测IL-1β水平。
1.5统计学方法
应用SPSS 22.0统计学软件分析数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1各组大鼠的一般情况
实验期间，空白对照组大鼠精神状态良好，体重稳定，毛发光滑，反应敏捷。模型组大鼠关节红肿，体重呈下降趋势，毛发呈灰色，行动迟缓，精神萎靡。玉米须黄酮提取物组和秋水仙碱组给药后精神状态较模型组明显好转，关节肿胀度减退，其中秋水仙碱组尤其明显。
2.2各组不同时间节点踝关节肿胀度的比较
模型组在各时间节点的踝关节肿胀度均高于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.01），表明模型制备成功；提取物高、中剂量48 h，中剂量组36 h的踝关口节肿胀度均高于空白对照组（P<0.05）；秋水仙碱组在各时间节点的踝关节肿胀度均低于模型组，差异有统计学意义（P<0.01），提取物高、中剂量组在24、36、48 h时的踝关节肿胀度低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）（表1），提示玉米须黄酮提取物可减轻AGA模型大鼠的关节肿胀度。
2.3各组大鼠血清尿酸水平的比较
模型组大鼠的血清尿酸水平明显高于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.01），表明模型制备成功；与模型组比较，提取物高、中剂量组及苯溴马隆组，血清尿酸水平明显下降，差异有统计学意义（P<0.01）（表2）。
2.4各组大鼠血清IL-1β表达水平的比较
模型组大鼠的血清IL-1β表达水平明显高于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.01），提示模型制备成功；与模型组比较，提取物高、中剂量组及秋水仙碱组大鼠血清IL-1β浓度降低，差异均有统计学意义（P<0.01）（表3）。
3讨论
AGA是由高尿酸血症引起尿酸盐结晶沉积在关节周围而引发的最常见的炎性关节。研究表明，痛风与高尿酸血症直接相关[11]，当人体血尿酸浓度>6.8 mg/dl 时会引起尿酸盐结晶，因此高尿酸血症是AGA的重要生化基础。传统的AGA模型制备多采用关节穿刺法注入尿酸钠，打破了高尿酸血症与AGA的内在联系，同时，有研究发现，除人类和猿类之外的哺乳动物体内存在尿酸分解酶，可将尿酸分解成尿囊素等排出体外，且其活性与尿酸浓度成正相关[12-13]。同时，局部关节的红、肿使血液流速加快，可增加尿酸钠的溶解度，使其加速进入血液并被其中的尿酸分解酶分解[14]。本实验采用改良方法诱导AGA模型，在尿酸酶抑制剂氧嗪酸钾诱导高尿酸血症模型的基础上采用关节穿刺法注入尿酸钠制备AGA模型，模型组大鼠踝关节造模后12 h关节肿胀，24 h肿胀达到高峰，血清炎症因子IL-1β、尿酸水平明显高于空白对照组，提示AGA模型制备成功。本模型可排除動物自身尿酸分解酶对尿酸的分解作用，符合人类的自然病程，更有利于客观全面地评价药物的疗效。
AGA急性发作病理过程中大量炎症因子的释放造成关节及周围组织病损。有研究发现，AGA及高尿酸血症患者血清中可检测到高浓度的IL-1β，在AGA急性发作期IL-1β的活性最高，可见IL-1β在AGA的病损过程中起重要作用，被认为是经典的AGA调节剂[15-16]。已有研究表明[17-19]，前炎症因子IL-1β的表达、成熟与分泌为AGA发病的主要机制，前IL-1β产生后通过MSU晶体激活中性粒细胞碱性磷酸酶3炎症体，促进IL-1β的成熟及分泌，最后释放至胞外的IL-1β可激活IL-1信号通路和髓样分化因子（MyD88）依赖的核因子-κB（NF-κB）通路，引起中性粒细胞募集及更多的炎症介质，产生炎症级联放大效应，从而引发关节红肿和关节炎急性发作。因此，通过阻断IL-1β的产生可影响AGA的发生、发展。
控制体内尿酸水平是治疗高尿酸血症和痛风的关键。目前对痛风急性发作的治疗多选择秋水仙碱、NSAIDs、糖皮质激素等药物；降尿酸药包括非布司他、别嘌呤醇、促尿酸排泄药、尿酸酶制剂等[20]，而同时缓解AGA发作的炎症反应和降尿酸的药物少有报道。
梁艳文等[21]的研究表明，玉米须黄酮醇提取物，中、高剂量组有抗炎活性，可改善二甲苯致小鼠耳廓的肿胀、蛋清致大鼠足跖的肿胀。律广富等[22-23]的研究表明，玉米须总黄酮提取物可缓解家兔关节滑膜组织炎症症状，促进痛风性肾病大鼠肾脏排泄尿酸。林贺等[24]的研究表明，玉米须黄酮提取物可降低痛风性关节炎大鼠IL-1α、IL-6、TNF-α及ICAM-1、MMP-1水平。
本实验通过氧嗪酸钾和尿酸钠干预，在排除动物自身尿酸分解酶对尿酸的分解的基础上，建立稳定并符合人类自然病程的AGA模型，研究结果显示，玉米须黄酮提取物中、高剂量可缓解AGA模型大鼠的关节肿胀度，显著抑制大鼠血清中IL-1β的表达水平，同时降低血清尿酸水平。本次实验结果提示玉米须黄酮提取物可缓解AGA模型大鼠的急性炎症反应，其机制可能与抑制IL-1β的表达，从而抑制炎症级联放大效应有关；同时降低血清尿酸水平，标本兼治。对于玉米须黄酮提取物通过何种信号通路影响IL-1β表达以及发挥降尿酸作用，仍有待进一步探索。
[参考文献]
[1]谢蓓蓓，苏厚恒.MSU晶体介导的痛风性关节炎的炎症机制[J].中华临床医师杂志，2013，7（16）：7518-7520.
[2]吴淑琼，曹春丽，章晶晶，等.痛风膏外敷治疗痛风性关节炎湿热蕴结证的疗效观察[J].现代医院，2018，18（1）：125-127，130.
[3]邱芳晖，张洪柱.刺血疗法治疗急性痛风性关节炎的效果及对血清代谢产物的影响[J].中国医药导报，2018，15（12）：135-139，封3.
[4]朱俭，王英丽，魏江波.痛风急性期中药的治疗优势[J].中华针灸电子杂志，2016，5（1）：42-44.
[5]柯渠青，邱晓堂，黄妮.小剂量秋水仙碱联合依托考昔治疗急性痛风性关节炎的临床观察[J].中国医药导报，2016， 13（33）：129-132.
[6]谢丽琴，李丽霞，黄应杰，等.“火郁发之”法火针治疗急性痛风性关节炎的临床效果[J].中国当代医药，2018，25（16）：190-193.
[7]朱旭.玉米须化学成分及药理作用研究概述[A]//中华中医药学会中药制剂分会.中华中医药学会第九届制剂学术研讨会论文汇编[C].2008：5.
[8]陈雅妮，李琼，任顺成.玉米须黄酮研究进展[J].安徽农业科学，2017，45（24）：131-133.
[9]郭志红，周鸿立.玉米须黄酮类化学成分及药理作用研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（8）：222-225.
[10]吕军，吕芳，方和金，等.高尿酸血症并急性痛风性关节炎大鼠模型的建立[J].中国现代医学杂志，2013，23（27）：11-16.
[11]郑敏，麻骏武.高尿酸血症和痛风的遗传学研究进展[J].遗传，2016，38（4）：300-313.
[12]金沈锐，秦旭.痛风及高尿酸血症动物模型的研究现状和评价[J].中国实验动物学报，2005，13（1）：55-58.
[13]金沈锐，郑军，刘绍唐.小鼠高尿酸血症模型初探[J].成都中医药大学学报，1999，22（1）：49-50.
[14]池继敏，张峰，张静，等.关节液各检验指标与关节炎类型的相关性[J].检验医学与临床，2015，12（1）：63-65.
[15]刘圳奋，马红霞，李秀宁，等.痛风性关节炎与高尿酸血症炎性细胞因子水平比较[J].西部中医药，2014，27（8）：157-158.
[16]曹建梅，王晓霞，郭景煜，等.IL-1β在痛风性关节炎中的致炎作用及臨床意义[J].中华临床医师杂志（电子版），2016，10（5）：728-731.
[17]周琦，刘树民，董婉茹.“TLR2/4-NF-κB”信号转导通路痛风性关节炎发病中的作用机制[J].中国药师，2016，19（9）：1733-1735.
[18]刘璐，张全波，青玉凤，等.加味四妙散汤剂对大鼠急性痛风性关节炎的疗效及可能作用机制的研究[J].新医学，2017，48（6）：375-379.
[19]Dhanasekar C，Rasool M.Morin，a dietary bioflavonol suppresses monosodium urate crystal-induced inflammation in an animal model of acute gouty arthritis with reference to NLRP3 inflammasome，hypoxanthine phosphoribosyl transferase，and inflammatory mediators[J].Eur J Pharmacol，2016， 786：116-127.
[20]陈光亮，周媛凤，张颖.治疗痛风和高尿酸血症药物研究进展[J].中国临床药理学与治疗学，2017，22（1）：104-109.
[21]梁艳文，孙贺，何罗香，等.玉米须纯化黄酮抗炎作用及急性毒性实验[J].吉林化工学院学报，2016，33（7）：13-16.
[22]律广富，仇志凯，常诗卓，等.玉米须总黄酮抗炎镇痛及对急性痛风性关节炎的改善作用研究[J].药物评价研究，2018，41（2）：206-209.
[23]律广富，仇志凯，常诗卓，等.玉米须总黄酮提取物对痛风性肾病大鼠肾脏尿酸排泄的影响[J].中成药，2018，40（6）：1373-1376.
[24]林贺，董金香，邱智东，等.玉米须黄酮提取物对痛风性关节炎大鼠的影响[J].现代食品科技，2015，31（4）：13-16.
（收稿日期：2018-06-12 本文编辑：许俊琴）
