刘婷 孙广超 曾华松
[摘要]目的 探討中重度疾病活动系统性红斑狼疮（SLE）患儿的淋巴细胞亚群临床特征，并比较治疗6个月后的相应变化。方法 回顾性分析2013年1月～2018年1月广州市妇女儿童医疗中心收治的114例中重度疾病活动SLE患儿临床资料，主要分析其免疫学指标及淋巴细胞亚群分类结果。根据疾病活动度评分（SLEDAI）分为中度活动组及重度活动组，比较组间有无差异，并将组间治疗6个月后的SLEDAI、淋巴细胞亚群计数及免疫学指标进行统计学比较分析。结果 114例患儿的平均年龄为（10.56±2.65）岁，女∶男=3.56∶1，SLEDAI评分为（15.21±3.95）分，其中、中度活动组49例，重度活动组65例。疾病重度活动组的补体C3及C4均明显低于中度活动组（P<0.05），淋巴细胞亚群分类结果显示，中度活动组的NK细胞（CD16+CD56+）计数明显高于重度活动组（P<0.05），重度疾病活动组的CD4+/CD8+比值明显低于中度活动组（P<0.05）。治疗6个月后的SLEDAI评分与首诊比较明显降低（P<0.05），IgG、IgA、IgE水平均明显减低（P<0.05），C4、CD8+ T淋巴细胞计数明显增高（P<0.05），CD19+ B淋巴细胞计数明显减低（P<0.05）。结论 免疫学指标联合淋巴细胞亚群分类能部分反映SLE患儿的临床治疗效果，SLEDAI在指导临床治疗及分级治疗中有重要作用，值得在儿科临床工作中加以推广。
[关键词]系统性红斑狼疮；疾病活动度评分；淋巴细胞亚群；儿童
[中图分类号] R725.9 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2019）4（b）-0105-05
[Abstract] Objective To analyze the clinical manifestations of lymphocyte subsets in systemic lupus erythematosus （SLE） children with moderate or severe disease activity， and to compare their corresponding changes after 6 months of treatment. Methods Clinical data of 114 patients with moderate and SLE disease activity index （SLEDAI） in Women′s and Children′s Medical Center of Guangzhou City from January 2013 to January 2018 were retrospectively analyzed. The immunological indicators and lymphocyte subgroup classification results were analyzed. According to the SLEDAI， patients were divided into the moderate activity group （MAG） and the severe activity group （SAG） for further contrast， and the SLEDAI， lymphocyte subsets and immunological indices after 6 months of treatment were compared and statistically analyzed. Results The average age of 114 children was （10.56±2.65） years old， with a 1∶3.56 male-female proportion. The score of SLEDAI was （15.21±3.95） points， with 49 MAG patients and 65 SAG patients. The complement C3 and C4 of MAG were significantly lower than that of SAG （P<0.05）. The NK cells （CD16+CD56+） of MAG was significantly higher than those of SAG （P<0.05）， and CD4+/CD8+ of the SAG were significantly higher than those of MAG （P<0.05）. The SLEDAI score after 6 months of treatment was significantly lower than that at the first visit （P<0.05）， and the level of IgG， IgA and IgE were significantly lower （P<0.05）， and CD19+ were lower， while C4 and CD8+ were significantly higer （P<0.05）. Conclusion Immunological indicators combined with lymphocyte subgroup classification can partly reflects the clinical treatment effect of SLE children patients， and has a good correlation with SLEDAI， which is worth promoting in clinical work.
[Key words] Systemic lupus erythematosus； Score of disease activity； Lymphocyte subsets； Children
系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种与遗传、环境、雌激素相关的复杂自身免疫性疾病，以多种自身抗体的产生及产生的循环免疫复合物导致多系统及器官受累为主要表现，其发病机制主要为免疫调节功能紊乱，表现为B细胞的耐受性降低及T细胞的分化和调节异常[1]。20%的SLE患者由儿童期起病，儿童的SLE较成人更易发生多系统损害，而且肾脏病变较成人严重，预后不良，因此评估SLE患儿的免疫功能状态在临床疾病评估及治疗中有重要意义[2]。流式细胞仪检测淋巴细胞亚群已较为广泛地被应用于儿科临床，本研究旨在分析中重度疾病活动的SLE患儿的淋巴细胞亚群临床表现，并比较其治疗6个月后的相应变化。
1资料与方法
1.1一般资料
选择2013年1月～2018年1月在广州市妇女儿童医疗中心诊断为SLE且病情活动度为中重度活动的患儿114例。纳入标准：①均符合美国风湿病学会1997年修订的SLE分类诊断标准；②根据SLE疾病活动性指数-2000（systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI-2K）[3]，入组患儿疾病活动度评分均≥10分，属于中重度活动；③具备完整临床及随访治疗。排除标准：①非首次就诊即明确诊断为SLE；②不具备完整临床资料或淋巴细胞亚群资料或免疫学指标随访资料不全；③SLEDAI评分<10分。入组患儿的年龄为5～18岁，平均（10.56±2.65）岁；其中女89例，男25例，女∶男=3.56∶1；SLEDAI评分（15.21±3.95）分；其中，中度活动组（SLEDAI评分10～14分）49例，重度活动组（SLEDAI评分≥15分）65例。本研究内容已通过医院医学伦理委员会审核，受试者及监护人均知情同意。治疗方案概述：入组患儿均接受注射用甲泼尼龙琥珀酸钠（5～10 mg/kg，3 d）及环磷酰胺（8～12 mg/kg，2 d）冲击治疗，间隔1个月/次，连续至少冲击治疗6次。期间以泼尼松或甲强龙片口服治疗，除有羟氯喹禁忌证的患者外，均以羟氯喹口服治疗，根据受累脏器不同，加用第二种免疫抑制剂（吗替麦考酚酯、甲氨蝶呤、环孢素等）。
1.2研究方法
回顾性分析所有入组患儿的免疫学指标及淋巴细胞亚群分类结果，比较中度活动组与重度活动组的免疫学及淋巴细胞亚群表现有无差异，并将两组治疗6个月后的结果进行统计学比较分析。
1.3实验室方法
1.3.1淋巴细胞亚群测定的主要试剂和仪器 EPICS-XL型流式细胞仪、LH750型全自动五分类血液分析仪（均为美国Beckman-Coulter公司产品），IMMUNOPREPTM全血溶解试剂、荧光标准微球Flow-Check（均为美国Beckman-Coulter公司产品）；pH=7.2的PBS磷酸盐缓冲液（中国鼎国公司）；标记单克隆抗体：CD3-PerCP-Cy5.5、CD56-PE-CY7、CD4-FITC、CD8-PE、CD19-APC、CD16-PE（BD公司，美国）。
1.3.2免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM、IgE）及补体（C3、C4）测定的主要试剂和仪器 IMMAGE型双光径免疫浊度分析仪（美国Beckman-Coulter公司），采用该公司的配套试剂。
1.3.3样本处理 ①淋巴细胞测定的样本处理：收集患儿入院治疗前和治疗6个月后EDTA抗凝静脉血2 ml（1.8 mg/ml EDTA-K2抗凝）进行白细胞分类计数测定，并取100 μl置入样品测定管，进入荧光标记单克隆抗体CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP-Cy5.5；CD3-PerCP-Cy5.5/CD19-APC/CD16-PE/CD56-PE-CY7震荡混匀，室温下避光孵育30～50 min，应用COULTER Q-PREP工作站和全血溶血试剂盒对样品进行溶血处理，充分裂解红细胞，弃去上清液，用PBS缓冲液洗涤2次，并加入200 μl重悬并使用流式细胞仪FACS Canto Ⅱ cytometer （Becton Dickinson），每个样本收集5×104～20×104个细胞，进一步检测外周血淋巴细胞中总T细胞（CD3+）、辅助/诱导T细胞（CD4+）、抑制/细胞毒T细胞（CD8+）、B淋巴细胞（CD19+）及NK细胞（CD16+CD56+）的表达水平及CD4+/CD8+比值。采用FlowJo software （v7.6.1）（Tree Star，San Carlos，CA）软件进行數据分析。免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM）及补体（C3、C4）测定的样本处理：收集患儿新鲜静脉全血，离心（转速3000 r/min），取血清上机检测。
1.4.统计学方法
采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料首先进行正态性检验，满足正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，治疗前后比较使用配对t检验；不满足正态分布的计量资料则用中位数和四分位数形式表示，组间比较使用Mann-Whitney U检验，治疗前后比较使用Wilcoxon检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1两组首诊患儿免疫六项结果测定的比较
中度活动组与重度活动组SLE患儿相比，IgG、IgA、IgM、IgE水平差异均无统计学意义（P>0.05），疾病重度活动组的补体C3及C4均低于中度活动组（P=0.001， 0.04）（表1）。
2.2两组首诊患儿淋巴细胞亚群测定结果的比较
两组的T淋巴细胞及B淋巴细胞计数比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。中度活动组的NK细胞（CD16+CD56+）计数明显高于重度活动组（P<0.05），重度疾病活动组的CD4+/CD8+比值明显低于中度活动组（P<0.05）（表2）。
2.3首诊与治疗6个月后免疫学测定结果的比较
治疗6个月后的免疫学指标IgG、IgA及IgE测值与首诊比较明显减低，C4测值水平明显增高，差异均有统计学意义（P<0.05）（表3）。
2.4首诊与治疗6个月后淋巴细胞亚群测定结果的比较
治疗6个月后的SLEDAI评分与首诊比较明显降低，CD8+ T细胞计数明显增高，CD19+ B细胞计数明显减低，差异均有统计学意义（P<0.05）（表4）。
2.5首诊及治疗6个月后随访SLEDAI评分分布情况
首诊患儿SLEDAI评分重度活动人数为65例（65/114，57.0%），最高评分为25分（2/114，1.8%），≥20分16例（16/114，14.0%）；治疗6个月后随访SLEDAI评分重度活动人数为3例（3/114，2.6%），最高评分为20分，疾病无活动组58例（58/114，50.9%），疾病轻度活动组34例（34/114，29.8%）。
3讨论
本研究对患者疾病活动度进行评分的SLEDAI-2K是参照Gladman等制定的记分规则[4]，对患者过去10 d内的疾病活动情况进行评估，包括9个系统的24项临床指标，评分范围为0～105分，其中0～4分为基本无活动，5～9分为轻度活动，10～14分为中度活动，≥15分为重度活动。本研究中度活动组C3及C4水平明显高于重度活动组，这与郭静等[5]的研究结果（补体C3、C4的水平与SLEDAI成负相关）一致，即病情活动度越高补体水平可能越低。此外，本研究发现不同疾病活动组的淋巴细胞亚群分类中CD16+CD56+绝对值计数有统计学差异，这可能与自然杀伤细胞（natural killer cells）作为连接固有免疫和适应性免疫的桥梁细胞，既是早期到达炎症部位的固有免疫细胞之一，又参与了清除机体自身反应性T、B细胞的功能有关[6]。既往研究显示，SLE患者外周血的NK细胞计数减少[7]，而本研究提示疾病活动越严重NK细胞计数越低。本研究中有5例合并巨噬细胞活化综合征，均为重度活动病例（SLEDAI评分15～22分不等），NK细胞计数均严重低下（NK细胞绝对值计数11～58个/μl）。Cruz-González等[8]的研究显示NK细胞调节功能的损害以及数突样NK细胞数量的增加，可能在SLE的疾病进展中起重要作用，提示NK细胞可作为未来SLE的治疗靶点。
T淋巴细胞是一种重要的免疫活性细胞，亚群对机体免疫功能的稳定起着重要的调节作用，其能使机体产生适度的免疫应答，使之既能清除异物抗原又不至于损伤自身组织。T淋巴细胞表型异常是反映自身免疫性疾病患者免疫调节功能紊乱的重要指标[9]，CD4+/CD8+ T淋巴细胞免疫失衡是SLE的特点之一。CD4+辅助T细胞对抗体产生和组织炎症起主要作用，并且易于与SLE和狼疮性肾炎的发展相关联[10]。本研究中，CD4+/CD8+比值在不同疾病活动组间比较差异有统计学意义，这与国外学者的研究结果（CD4+/CD8+比值随着疾病缓解可上升）一致[11]，且本研究提示减低程度与疾病活动度评分相关，这与顾卫军等[12]的研究吻合。本研究中，免疫球蛋白水平在不同疾病活动组间差异无统计学意义，这与谢红付等[13]的研究（重度疾病活动的SLE患者IgG水平与中度及轻度疾病活动有差异）不同。
本研究中的病例根据病情均选择了注射用甲泼尼龙琥珀酸钠加环磷酰胺的双冲击疗法，根据病情不同选择不同的免疫抑制剂序贯治疗。初诊与治疗6个月后比较，重度活动人数由65例（65/114，57.0%）减少至3例（3/114，2.6%），治疗6个月后3例重度活动SLE患儿均为女性，其中两例合并狼疮性脑炎，以头痛、抽搐为表现，另外1例则合并感染、关节炎和肾脏受累，而这3例患儿初诊时的SLEDAI评分2例为15分，1例为14分，提示临床医生需密切关注SLE患儿神经系统受累情况及感染情况，这对病情控制意义重大[14]。本研究前后对比的SLEDAI-2K评分明显减低，差异有统计学意义（P<0.05），提示治疗效果良好。免疫学指标中IgG、IgA及IgE均有显著差异，经治疗后上述免疫球蛋白水平下降较明显，这与SLE疾病的特点之一为B细胞过度增殖、活化以及B细胞的免疫耐受被打破从而产生多种抗体导致多脏器损害有关[15]。
此外，初诊组和治疗6个月组的淋巴细胞亚群分类结果比较，CD8+ T淋巴细胞计数明显上升而CD19+ B淋巴細胞明显降低，其原因可能如下。①Singh等[16]通过NZB/W第一代小鼠及人类单克隆抗DNA实验小鼠模型均发现CD8+ T淋巴细胞的增殖及其产生的TGFβ和FoxP3可抑制SLE疾病活动期抗ds-DNA抗体及Ⅱ-IFN的产生和CD4+ T淋巴细胞的增殖；而SLE疾病缓解期随着自身抗体的恢复正常CD8+ T淋巴细胞随之下降。②Dal等[17]的研究发现SLE患者的CD3-CD19+ B淋巴细胞计数与SLEDAI评分成负相关。既往国内多家研究显示SLE患者活动期B淋巴细胞均存在异常活化，且多数研究的结果提示B淋巴细胞的计数在疾病活动期明显增高，这与B淋巴细胞刺激因子及调节性B淋巴细胞的功能失衡也有一定关系。
本研究为回顾性临床研究，收集资料过程中可能存在偏差，且有部分临床数据缺失，可能影响到最终统计结果。但是综合看来，免疫学指标联合淋巴细胞亚群分类能部分反映临床治疗效果，并且与SLEDAI有良好的相关性，值得在临床工作中加以推广。
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（收稿日期：2018-02-02 本文编辑：祁海文）
