周子人 李贵华 余林
【摘 要】 目的：了解当下时间段辖区内流感流行的类别。方法：抽取辖区某段时间内流感样病例，通过实时荧光PCR检测方法对所采病例样本进行检测，确证是否为流感病例，并对阳性病例进行流感类别分型。结果：在5所医院共收集流感样病例标本41例，有效标本40例，甲型流感病例30例，阳性率为75<%，全部为甲流H1N1型，乙型流感病例1例，为乙流Yamagata型。结论：辖区内主要流行群为甲流H1N1型，发现1例乙流病例，不是辖区内主要流行群，未发现H7N9流感病例。
【关键词】 流感 流感样病例 H1N1 H7N9
Abstract Objective： Understanding the influenza epidemic category in jurisdictions in the current time. Methods： Detecting the samples by real-time PCR. Classifying the positive samples. Results： A total of 41 cases of influenza-like illness cases are collected in 5 hospitals， 40 cases are valid samples. 30 cases are influenza A（ the positive rate was 75%）， which all are H1N1 type. 1 case is influenza B， which is Yamaiata type. Conclusion： The main epidemic group is H1N1of influenza A. 1 case of Yamagata of influenza B is found， which is not the main epidemic group in the area. H7N9 has not been found.
Keywords Infuenza； Influenza-like illness case； H1N1； H7N9
【中图分类号】R249.8 【文献标识码】A 【文章编号】1672-3783（2019）01-03--01
流行性感冒（ influenza，以下简称流感） 是由流感病毒引起的一种传染性强、传播速度快的急性呼吸道传染病，是WHO实行全球监测的传染病[1]，全球每年有5～10%的成年人和20～30%的儿童感染流感[2]，学龄前儿童（5岁及以下）更是流感的易感人群和高发人群[3]。根据病毒的核蛋白、M1蛋白抗原性和基因特性等方面的差异，流感病毒可分为甲、乙、丙三型，其中甲型最易发生变异，常引起大流行和中小流行；乙型流感病毒变异较少，感染人类后， 可引起暴发或小流行；丙型较稳定，多为散发病例[4-5]。禽流感则是甲型流感病毒感染禽类后引起的禽类呼吸道感染性疾病，其中高致病性禽流感病毒突破种属屏障感染人类后，称为人感染高致病性禽流感。
2017年5月，郫都区辖区内发生人感染高致病性禽流感H7N9疫情，出现人感染高致病性禽流感H7N9患者，且出现死亡病例，在禽类相关的环境，如活禽交易市场、菜市场宰杀点、农贸市场排污沟内等多次检测出高致病性禽流感H7N9病毒核酸，经过卫生部门的努力和各相关单位的配合，采取了严格的防控措施，疫情得到控制，并于2017年7月终止疫情。随着秋冬季节的到来，流感进入常规发病高峰时节，醫院门诊流感样病例明显增多，2017年底，全国出现了一次乙型Yamagata型流感发病小高峰，作为刚刚经历过禽流感疫情的区域，经过媒体对流感疫情的报道，政府和群众对相关信息关注度较高。为进一步了解和掌握辖区内流感发病具体情况，区疾控中心选取部分医院，对流感样病例进行采样和检测，对辖区内流感流行情况进行初步的了解，为评价和指导今后的流感防控工作提供科学的依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本来源 分区域选取辖区内主要医疗机构，集中时间段（3天内）收集流感样病例（ influenzalike illness，ILI）咽拭子，送至区疾控中心实验室进行核酸检测。41份样品均来自辖区内固定居住人群，其中12岁以下儿童19人，成人22。
1.1.2 试剂 流感核酸检测试剂盒（甲、乙、丙型流感核酸检测试剂盒，H1N1/H3双通道流感核酸检测试剂盒，H7N9双通道流感核酸检测试剂盒，乙型流感Victoria/Yamagata分型检测试剂盒，H5型流感核酸检测试剂盒，H9型流感核酸检测试剂盒）和人核糖核酸酶P核酸检测试剂盒均来自硕世生物。核酸提取试剂来自Promega。
1.1.3 仪器 ROCHE 480Ⅱ型实时荧光PCR仪，Promega全自动核酸提取仪，A2型生物安全柜。
1.2 方法
1.2.1 核酸提取 使用Promega全自动核酸提取仪进行提取，病毒采样管震荡混匀15s，取200μl样品加入到无RNA酶的EP管中，再加入200μl细胞裂解液和20μl蛋白酶K，轻轻吹打混匀，室温静置15分钟后加入到核酸提取条中，放入全自动核酸提取仪进行自动提取。
1.2.2 核酸检测 对样品先进行甲、乙、丙三型流感病毒分型检测，阳性样品再进行甲、乙、丙型流感具体分型；阴性样品进行人核糖核酸酶P（RNP）核酸检测，阳性样品为有效样品，表明采集到口腔上皮细胞，采样合格，阴性样品未采集到人口腔上皮细胞，为无效样品，最后不纳入数据统计。PCR反应体系均为25μl，其中PCR 反应液20μl，模板5μl ；实时荧光PCR 扩增条件均为：50℃ 30min、95℃ 5min；95℃ 10s、55℃ 40s（在此阶段结束时收集荧光信号），循环45次，FAM通道和VIC通道采集荧光信号，其中FAM通道采集H1N1、H5、H7、H9信号，VIC通道采集H3、N9信号，阳性对照Ct≤30，阴性对照无扩增曲线时实验有效。样品Ct值<35时，判定为阳性样品；Ct值>38时判定为阴性样品；35≤Ct≤38时，重复检测一次，Ct值<35或仍在此范围内判定为阳性样品，；Ct值>38判定为阴性样品。
2 結果
2.1 RNP检测 12号样品RNP检测阴性，未采集到人口腔上皮细胞，为无效样品，予以剔除，结果不纳入最后统计。12号样品为成人组样品。
2.2 甲、乙、丙三型流感病毒分型检测 40份样品进行流感分型检测，其中甲型流感病毒核酸阳性样品30份，阳性率为75%，其中12岁及以下儿童15例，阳性率为37.5%，成人15例，阳性率也为37.5%；乙型流感病毒核酸阳性样品1份，阳性率为2.5%；无丙型流感病毒核酸阳性样品；流感病毒核酸阴性样品10份。H1N1流感病毒核酸实时荧光
2.3 甲型流感病毒分型检测 30份甲型流感病毒核酸阳性样品同时进行H1N1、H3、H5、H7N9、H9甲流分型检测，30份甲型流感病毒样品均为H1N1型甲流，具体年龄组分布见表1，H1N1流感病毒实时荧光PCR检测结果见图1。
2.4 乙型流感病毒分型检测 对乙型流感病毒核酸阳性样品进行Victoria/Yamagata分型检测，结果显示为Yamagata型乙型流感病毒。
3 讨论
2017年5月郫都区辖区内出现了人感染高致病性禽流感H7N9疫情，且出现重症死亡病例，相关部门采取了一系列预防控制措施，因此辖区内各部门和民众对流感关注度较高。进入秋冬季后，辖区内各医院流感样病例数明显增多，政府部门和民众对此均高度关注。以往研究表明，冬春季节为华南地区流感流行的传统高发季节[6-8]，在辖区内对流感样病例做一次小范围的调查，摸清辖区内流感流行的主要型别，对流感的防控工作和疫苗接种计划有很大的指导意义。经调查显示，所采集的流感样病例标本流感核酸阳性率为77.5%，其中甲型流感H1N1核酸阳性 30例，检出率为75%，为辖区内主要流行的流感型别，同时未发现其他甲型流感型别，表明在郫都区辖区范围内，主要流感流行群为甲型流感H1N1型，且流行型别单一，未见其他甲型流感型别，通过针对性疫苗接种和防控措施，能够有效的预防和控制辖区内流感疫情的爆发。通过粗略的年龄组阳性率对比研究，成人和儿童的甲型流感H1N1核酸阳性检出率没有统计学意义，表明甲型流感H1N1在辖区内全人群分布较为均匀，没有年龄差别，为了更好的预防流感病毒感染，控制流感疫情发生，各年龄人群均需要接种流感疫苗；乙型流感病毒核酸检出1例，为乙型流感Yamagata型，与媒体报道的秋冬季国内乙型流感以Yamagata型流行为主相符，但在本次调查中，乙型流感病例仅检出一例，表明其为散发病例，并未在辖区内流行，与媒体报道的乙型流感流行不符；此次小范围调查中未发现高致病性禽流感H7N9病例，表明经过2017年的各种防疫措施，如关闭活禽交易市场、禁止市场活禽点杀，以及全年度的环境流感核酸监测等取得了很好的效果，有效的控制了甲型H7N9流感疫情。
通过本次研究，基本了解了辖区内主要的流感流行类别，达到了进行该项调查研究的目的，为辖区内疫苗接种计划和进一步的疫情防控提供了基本信息，对辖区内的流感防控工作具有很大意义。
参考文献
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