潘婷 宰青青 王翠肖
【摘要】目的：建立大鼠酒精性肝纤维化模型，观察造模过程中大鼠肝组织的变化及建模的可行性。方法：取40只Wistar雄性大鼠，随机分为造模组（n=30）和正常对造组（n=10）。造模组予“60%乙醇-吡唑-玉油”混合液灌胃（1次/天）制备酒精性肝纤维化大鼠模型，正常对照组予等量生理盐水灌胃。于造模12、16、24周末分批心脏采血，以测定肝功能指标，后行放血法处死。取出肝组织先称重再行HE染色法观察肝组织的病理变化。结果：与正常对照组比较，造模组大鼠肝指数、血清ALT和AST明显升高，差异具有统计学意义。在造模12周末呈现轻度酒精性肝纤维化，随着造模时间的延长肝纤维化逐步加重，但并未呈现肝硬化的表现。结论：应用“60%乙醇-吡唑-玉米油”混合液灌胃法可成功建立大鼠酒精性肝纤维化模型。
【中图分类号】R249【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2019）06-035-01
酒精性肝纤维化（Alcoholic liver fibrosis，ALF）是因为在乙醇、乙醛的慢性持续性损伤作用下，肝脏纤维组织大量增生，而基质金属蛋白酶/金属蛋白酶组织抑制剂调节失衡，最终导致细胞外基质大量沉积的结果[1]，随着我国经济水平的提高以及饮酒文化的影响，引发的ALF患病率越来越多。而ALF是病情逆转的关键点[2-3]，它可阻断病情向肝硬化的发展。目前研究酒精性肝纤维动化动物模型比较多，但想要迅速建立一个简便、经济实惠、稳定性强、周期短、成功率高的模型比较困难，本文在前人研究的基础上[4-6]，对造模方法稍加改进，拟在探讨60%乙醇-吡唑-玉米油联合造模的可行性。
1 材料
1.1 仪器
ELX800-MV型酶标仪（美国Bio-Tek公司）;AO-820手动石蜡切片机（英国制造）;IX71型倒置显微镜（日本Olympms 公司）。
1.2 药品与试剂
无水乙醇（重庆川东化工集团有限公司，批号：20160201）;丙氨酸转氨酶（ALT）测定试剂盒（南京生物建成有限公司，批号： 20160911）;天冬氨酸转氨酶（AST）测定试剂盒（南京生物建成有限公司，批号：20161011）;玉米油（山东鲁花集团有限公司）;吡唑（上海阿尔丁生化科技股份有限公司）
1.3 动物
健康Wistar雄性大鼠40只，体重为180～220g，SPF级（辽宁长生生物科技有限公司提供，许可证号SCXK（辽）2015-0001。
2 方法
按照文献中的方法[4-6]并加以改进。将40只雄性Wistar大鼠正常喂养1周后随机分为造模组（n=30）和正常对照组（n=10），造模组每日予60%乙醇、玉米油、吡唑按质量比1000：250：3混合成混悬液灌胃，第1周灌胃剂量6mL/kg/d，，第2周灌胃剂量8mL/kg/d，第3周灌胃剂量10mL/kg/d，第四周灌胃剂量12mL/kg/d，以后维持此量直至24周末。同时正常对照组予等量生理盐水灌胃。各组大鼠正常饮食。在造模12、16、24周末分批禁食、禁饮12h，称定大鼠体重。用10%水合氯醛（0.4mL/100g）麻醉固定后，心脏取血，抽取5～10mL血液，于室温环境下搁置30分钟，离心（3000rpm，15min）取上层血清，待测血清肝功能指标。取出肝组织，精确称取肝总量并计算肝指数。取一部分肝组织用10%中性福尔马林固定。
2.1 检测血清肝功能指标按照试剂盒说明书操作，采用微板法测定血清中ALT和AST的含量。
2.2 计算肝指数肝指数=肝质量（mg）/体质量（g）×100%
2.3 组织病理学指标检测各组大鼠肝组织在10%中性福尔马林固定24h后，经脱水、石蜡包埋、切片后，进行苏木精-伊红（HE）染色。于电子显微镜下观察肝脏病理学变化。
2.4 统计方法采用SPSS17.0软件进行统计分析。计量资料以x±s表示，组间比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
3 结果
3.1 各组大鼠血清ALT和AST的活性与正常对照组比较，各造模组ALT 和AST明显升高（P<0.01），随着酒精刺激时间的延长，ALT和AST升高更加显著。见表1.
3.2 大鼠肝指数的测定结果与正常对照组比较，各造模组大鼠体重显著下降（p<0.05或p<0.01），肝指数明显升高（p<0.05或p<0.01）。结果见表2
3.3 肝組织病理学观察
各组大鼠行HE染色镜下可见：正常对照组见肝细胞排列整齐，细胞核大而圆，有1个至数个核仁，多核细胞多见，肝板以中央静脉为中心呈放射状分布。造模12周见肝细胞脂肪变性，大量炎细胞浸润，可见窦周有少量纤维组织沉积。造模16周肝细胞脂肪变性加重，有大量脂滴溢出，肝细胞坏死和炎细胞浸润明显，汇管区有大量纤维组织沉积。造模24周肝细胞坏死、炎细胞浸润更加严重，中央静脉、汇管区及其汇管周围有大量纤维组织沉积，部分肝小叶被破坏但未出现酒精性肝硬化的表现。
4 讨论
目前关于酒精性肝纤维化造模的方式有很多，如Liber-Decarli液体食料模型[7]和Liber-Decarli液体食料加辅剂模型[8]等模型，但由于大鼠天生厌酒，加之实验周期长，费用高、成功率比较低，已经很少采用。目前比较常用的是酒精-吡唑-玉米油混合液灌胃法复制酒精性肝纤维化模型，该模型操作简单、周期短，成模率高。本次实验中，造模大鼠12周出现了轻度的酒精性肝纤维化，而且随着造模时间的延长，肝纤维程度逐渐加重，至造模24周汇管区及汇管周围出现大量纤维组织沉积，许多肝小叶结构被破坏，但并导致酒精性肝硬化的表现。采用酒精-吡唑-玉米油混合液灌胃法可成功制备酒精酒精性肝纤维化模型。
參考文献：
[1]Hendriks H F J，Bosma A，Brouwer A.Fat-storing cells：Hyper-and hypovitaminosis A and the relationships with liver fibrosis [J].Semin Liver Dis，1993，13（1）：72-80.
[2]Schuppan D，Kim Y O . Evolving therapies for liver fibrosis[J].Journal Of Clinical Investigation ，2013，123（5）：1887-1901.
[3]YeZ，Houssein H S，Mahato RI.Bioconjugation of oligonu-cleotides for treating liver fibirosis[J].Oligonucleotides，2007，17（4）：349-404.
[4]丁霞，蒙一纯，贲长恩等，酒精性肝纤维化动物模型的建立[J].中国中医基础医学杂志，1999，5（7）：47-48
[5]杨莹帆，郑希元，赵欣等。丹参粉针剂对酒精致大鼠慢性肝纤维化的保护作用[J].中国新药杂志，2014，23（21）：2556-2559.
[6]陈宏辉，张明亮，阳学风，等，骨调素对巨噬细胞在酒精性肝纤维化肝组织局部浸润的影响[J].肝脏，2004，9（4）：244-246.
[7]Lieber C S，Decarli L M.The feeding of ethanol in liquid diets[J].Alocoholism-Clinical & EXPERIMENTAL Research，2010，10（5）：550-553
[8]YOKOYAMA H，NAGATA S，MORIYA S，etal.Hepatic fibrosis produced in guinea pigs by chronic ethanol administration and immunization withacet adehyde adducts[J].Hepatology，1995，21：1438-1442.
