孙志伟 李红月
【摘要】目的：建立测定天麻药材中两种主要化学成分的HPLC含量测定方法;在此基础上，测定宜昌栽培天麻天麻素、对羟基苯甲醇含量与栽培年限之间的变化关系。方法：采用HPLC对不同生长年限栽培天麻中天麻素、对羟基苯甲醇含量进行测定。结果：天麻中各天麻素、对羟基苯甲醇含量随栽培年限变化较大。结论：本方法简便、可靠，可用于天麻中天麻素、对羟基苯甲醇含量测定。
【关键词】天麻;不同年限;含量测定;HPLC
天麻为兰科植物天麻GastrodiaelataBlume的干燥块茎，主产于云南、四川、陕西、贵州、湖北等地，具有平肝息风、祛风定惊、镇静、镇痛等功效[1]，含有酚类、多糖、甾醇、有机酸等多种成分[2]，而天麻素、对羟基苯甲醇等酚类化合物通常被认为是天麻的主要活性成分。2015年版《中国药典》（一部）规定，按干品计，天麻素和对羟基苯甲醇总含有量不得低于0.25%[3]，也是以天麻素及对羟基苯甲醇的含量作为天麻质量评价指标。
宜昌是天麻栽培主产区之一，然天麻种植多以农户散种为主，种植规范性较差，采收年限存在较大差异[4]。天麻属多年生植物，作为次生代谢产物的苷类等有效成分的积累可能与植物的生长年限存在相关性。然而对于天麻栽培品栽培年限对天麻有效成分积累的研究，国内外文献少有报道。基于此，本研究以天麻素、对羟基苯甲醇为指标研究天麻栽培品栽培年限与天麻有效成分积累的关系。
1 仪器与试药
Waters高效液相色谱仪， 含Waters2690色谱工作站（美国Water公司）;TC-C18色谱柱色谱柱，（4.6mmx250mm，5μm）（安捷伦公司）;BT-125D型电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）;KQ-500B型超声波振荡清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;天麻素（中国食品药品检定研究院，批号110807-200205）;对羟基苯甲醇（中国食品药品检定研究院，批号111970～201405）。
色谱分析用乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）;水为娃哈哈纯净水;其他试剂均为分析纯。
不同年限天麻栽培品均采集自宜昌市夷陵区聚宝天麻专业种植基地。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
流动相为乙腈-0.05%磷酸（5：95）。流速为l.OmL.min-1。波长210nm，柱温30℃。
2.2 对照品溶液制备
精密称取天麻素对照品10.6mg及对羟基苯甲醇对照品5.8mg，加50%甲醇定容于5 0mL容量瓶中，制成浓度为含天麻素0.212mg/mL、对羟基苯甲醇0.116mg/mL的混合对照品溶液储备液。取上述溶液lOμL进样，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图（见图1）。
2.3 供试品溶液制备
取天麻，粉碎，过5号筛，精密称定细粉约lg，加60%甲醇超声提取30min，过滤，取滤液定容于lOOmL容量瓶中，摇匀。再用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。取各供试品溶液lOμL进样，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图（见图2）。
2.4 工作曲线绘制
精密吸取2.2项下对照品储备液0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、8.Oml，定容于lOml容量瓶中，上述溶液进样lOμL，测定峰面积，以对照品浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，得线性回归方程为：天麻素Y=235.742X+0.764，F0.9996， 线性范围为0.01-0.16μg/mL，对羟基苯甲醇Y=396.745X+1.064.F0.9994，线性范围为0.01-0.12μg/mL。
2.5 精密度试验
吸取等体积的对照品溶液10μL，连续进样，按“2.1”项条件下测定5次，记录两峰峰面积。结果天麻素的RSD值为0.64%（n=5），对羟基苯甲醇的RSD值为0.43%（n=5），均显示仪器精密度良好。
2.6 稳定性试验
精密吸取3年生天麻供试品，分别于0、2、4、6、8、lOh测定，结果天麻素的RSD值为3.18% （n=6），对羟基苯甲醇的RSD值为2.45%（n=6），表明样品溶液在lOh内较稳定。
2.7 重复性试验
取3年生天麻粉末lg，按“2.3”项下制备供试样品溶液6份，在“2.1”项条件下色谱条件下进样lOμL，根据线性回归方程计算天麻素、羟基苯甲醇含量，結果天麻药材中天麻素的含量平均为2.69mg.g-1，RSD=0.96% （n=6）;对羟基苯甲醇的含量平均为1.16mg-g-1，RSD=1.31% （n=6）。
2.8 加样回收率试验
精密称定天麻样品0.5g，精确加入约5mg天麻素及对羟基苯甲醇对照品，混匀后，按“2.1”项下方法重复测定5次，天麻素平均回收率为102.12，RSD=3.48%，对羟基苯甲醇平均回收率为98.47，RSD=2.68%。
2.9 样品含量的测定
取宜昌市夷陵区聚宝天麻专业种植基地采集的栽培期限为1-4年生的天麻药材4批，干燥后，按“2.3”项下方法处理。精密吸取供试品溶液，进样lOμL，用外标法测定含量，不同栽培年限天麻天麻素、对羟基苯甲醇含量见见表l。
3 讨论
（l）在提取方式考察上，本实验采用正交实验法考察不同浓度的甲醇、乙醇作为溶剂及不同提取时间等因素对提取率的影响，最终确定本实验采用的60%甲醇超声提取30min的最佳提取方法。
（2）本实验考察了乙腈一水、乙腈一磷酸溶液、乙腈一三氟乙酸、乙腈一乙酸铵溶液等流动相体系，结果发现乙腈-0.05%磷酸分离效果较好。
（3）在对湖北宜昌不同栽培年限天麻进行含量测定，发现1-4年生栽培天麻均符合药典标准。但1-3年生天麻，随着栽培年限的提高，天麻素与对羟基苯甲醇总量有所下降，可能是由于此生长阶段，药材生长速度较快，淀粉、纤维素等初级代谢产物积累较多，其积累速率大于有效成分积累速率所致;第4年天麻素与对羟基苯甲醇含量有所提升，也可能由于此时药材增重速率变慢，有效成分积累速率相对更快所致。
参考文献
[1]李云，王志伟，耿岩玲等，天麻素注射液的药理机制及临床应用研究进展[J].中国药房，2016，27 （32）：4602-4604.
[2]吴仲珍，李育生，刘丽丹等.天麻有效成分的药理功效及其提取工艺的研究进展[J].保鲜与加工，2014，14 （03）：5861.
[3]国家药典委员会，中华人民共和国药典：201 5年版一部[S].北京：中国医药科技出版社，2 015： 59.
[4]张跃进，梁锁，周元等，不同栽培措施对天麻产量和产量结构的影响研究[J].安徽农业科学，2009， 37 （03）：1134-1135.
