胥冰 张丽君 郭小兰 石小玲
【摘要】目的 观察不同剂量千佛菌含药血清对H22小鼠肝癌细胞增殖、凋亡的影响。探讨其抑瘤作用机制。方法 制备H22小鼠肝癌细胞分别与大鼠空白血清及含不同剂量千佛菌的药物血清在体外共同培养。四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测H22肝癌细胞增殖情况；流式细胞技术检测H22肝癌细胞凋亡率。结果 与模型组比较，千佛菌大、小剂量含药血清在作用24 h、48 h、72 h后均能抑制H22肝癌细胞增殖，差异有统计学意义（P<0.05），抑制率以大剂量、48h最高（P<0.01）；流式细胞技术检测，大、小剂量含药血清均可诱导凋亡，大剂量作用48h，凋亡率较高，与模型组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 千佛菌含药血清能抑制H22小鼠肝癌细胞的生长，其作用机制可能与其抑制H22细胞增殖，诱导细胞凋亡有关。
【关键词】千佛菌含药血清；细胞增殖；细胞凋亡
【中圖分类号】R-5 【文献标识码】B 【文章编号】ISSN.2095.6681.2018.27..02
1 材料与方法
1.1 药品、试剂
药材为陕西镇安县千佛菌种植基地千佛菌；四甲基偶氮唑蓝（MTT，Sigma）；二甲基亚枫（DMSO，Sigma）；RPMI1640培养液（Hyclone）；胎牛血清。
1.2 主要仪器
5%CO2培养箱（BindCD-150），超净工作台（苏州安泰），倒置荧光数码显微镜NikonTS-100F（DS-5MC），精密电子天平（德国赛多利斯股份公司），流式细胞仪（BD，美国），二氧化碳恒温细胞培养箱（BINDER C150）。
1.3 实验动物、瘤株
SD大鼠20只，体质量（250±5）g，购自西安交通大学实验动物中心，合格证号：SCXK（陕）2007-001。小鼠H22肝癌细胞株，我校免疫室赠予。
2 实验方法
2.1 含药血清的制备及灭活
大鼠适应性喂养一周后随机分为4组（n=4）：空白组；模型组；含药血清大、小剂量组。含药血清组，取500 g千佛菌加水大火煮沸转文火煎煮120 min，此法煎煮2次，合并两次滤液并浓缩至0.5 L相当于1 g/mL生药量为原液，以原液为大剂量即100%浓度；生理盐水倍比稀释后为小剂量即50%浓度2.5 g/（kg·次）灌胃给药，2次/d。空白组，给予同剂量生理盐水[3]。连续7 d，末次灌胃2 h后，麻醉，采血，无菌分离血清，56℃，30 min灭活处理，用
0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，置-20℃冰箱保存备用。
2.2 MTT法检测千佛菌含药血清对H22细胞增殖的影响
从液氮中取出H22细胞株复苏。用含10% FBS 的1640培养基在37℃含5%CO2的孵箱中培养，至对数生长期，将其制备成密度为3×106/mL细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔100 μL。空白组加入1640培养液，含药血清大剂量组加入100 μL100%含药血清；含药血清小剂量组：加入100 μL100%含药血清，对照组：加入100 μL正常大鼠血清。每组设3个平行孔，培养24 h、48 h、72h后，每孔加入
5 mg/mL的MTT10 μL，培养箱中继续培养4 h后，弃掉上清，每孔加入150 ul DMSO，振荡10 min，待结晶充分溶解，酶标仪490 nm处测定吸光度（A），计算抑制率。生长抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。
2.3 流式细胞仪检测H22细胞凋亡
据MTT实验结果最终选定各组在48 h为最佳作用时间，将培养24 h的H22细胞，取两瓶，分别加入大小剂量含药血清，作用48 h，收集各组细胞，PBS洗涤2次，75%冰乙醇固定，避光加入碘化丙啶（PI）染液混匀30 min，流式细胞仪检测，计数10000个细胞，检测凋亡率，实验重复3次，取均值。
2.5 统计学方法
采用SPSS 20.0统计软件对数据进行处理，计量资料以“x±s”表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
3 结 果
3.1 千佛菌含药血清对小鼠H22肝癌细胞增殖的影响
大、小剂量千佛菌含药血清均对H22肝癌细胞的增殖有抑制作用 ，但大剂量更为明显。抑制率呈明显的时间-剂量依赖性，充分说明千佛菌能够抑制肿瘤的增殖。
3.2 流式细胞仪检测小鼠H22肝癌细胞凋亡
将不同剂量千佛菌含药血清加入H22肝癌细胞培养48 h后，经流式细胞仪检测，千佛菌含药血清大、小剂量均能诱导H22肝癌细胞凋亡，而以大剂量组作用更显著。与模型组相比，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.05）。
4 讨 论
千佛菌是一种药、食兼用的珍稀食用真菌。主要含多糖、维生素、蛋白质以及微量元素等，其主要活性成分及抗肿瘤成分为灰树花多糖，千佛菌具有“扶正固本”之功效。为祖国医学之扶正固本药，能增强机体的免疫力，改善症状，延长生存期，提高生活质量。本次实验，我们通过制备千佛菌大鼠含药血清，体外干预小鼠H22肝癌细胞24、48、72h发现均对H22肝癌细胞有一定的抑制增殖作用，且大剂量药效最好。
综上所述，本研究通过体外实验，验证了千佛菌含药血清对小鼠H22肝癌细胞增殖、凋亡的影响，证实了千佛菌对H22细胞有较好的抑制作用，为临床筛选抗肿瘤药物，尤其为开发天然的低毒或无毒药物提供了理论及实验依据，也为肿瘤疾病的临床治疗提供了新思路、新方法。
参考文献
[1]徐锦堂.中国药用真菌学[M].北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1997，第1版：707.
本文编辑：刘欣悦
