曾森 叶亚琼 李嘉怡 陈仁贵 娄华 朱海琦 李培文 吴志胜 刘霜霜 刘俊杰
【摘要】目的 为了探究“超级”细菌存在的可能性及人工方法是否会诱导产生“超级”细菌。
方法 实验采用以葡萄球菌为实验菌，按NCCLS推荐的纸片扩散法敏感试验测定12种抗菌药物对实验菌株的抑菌圈直径，并选出该菌株最敏感的药物头孢唑啉；经多次实验，发现用微量肉汤稀释法测定头孢唑啉对葡萄球菌的MIC值效果最佳，以及相对应的菌液稀释比例和药液与菌液混合的最适比例和一种使用头孢唑啉体外人工诱导葡萄球菌耐药的方法。结果 在实验室条件下，经过55代的传代诱导，细菌对β-内酰胺类药物产生完全耐药性；同时发现该耐药菌株对所测非β-内酰胺类抗生素（喹诺酮类、四环素类、氨基糖苷类和糖肽类）的敏感度增高，对氨基糖苷类的新霉素敏感度增加尤为明显，以及耐药菌株的形态学变化。结论 说明人工方法诱导产生“超级”细菌的可能性是比较小的。
【关键词】“超级”细菌；葡萄球菌；药敏实验；MIC
【中图分类号】R969 【文献标识码】A 【文章编号】ISSN.2095-6681.2019.5..02
“超级细菌”是具有多重耐药性细菌的总称，包括耐青霉素的金黄色葡萄球菌（PRSP）、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐万古霉素肠球菌（VRE）等[1]。葡萄球菌（Staphylococcus）作为化脓性感染、败血症或脓毒性败血症的主要病原体，常造成奶牛乳腺炎等化脓性或毒素性疾病，造成巨大经济损失，严重影响畜牧业的发展[2]。耐药菌是这些年来社会上的热议话题之一，特别是MRSA、“超级”细菌报道以来，一度造成社会上的恐慌，甚至曾有报道称：到2050年人类死于耐药菌的病例将超过癌症，科学家们对耐药菌的研究日益迫切。“超级”细菌的耐药性形成可能与用药剂量、用药频度与宽度（使用药物的频率与种类多少）、细菌的自身变异（物理、化学、生物性变异）等有关。细菌耐药性产生的原因极可能是细菌多次与药物接触（如抗生素滥用问题），导致细菌成为耐药菌。
1 材料与方法
1.1 细菌的来源与鉴定
葡萄球菌菌株由佛山科学技术学院广东省预防兽医重点实验室提供，经平板划线提纯、观察菌落形态特征、革兰氏染色镜检、高盐甘露醇培养基鉴定，特征与葡萄球菌一致。纯化菌株用50%甘油存于-20°C冰箱备用。
1.2 试剂和仪器
药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司，批号分别为：头孢唑啉（批号：S1012）、头孢他啶（批号：S1019）、青霉素（批号：S1001）、苯唑西林（批号：S1002）、氨苄西林（批号：S1003）、万古霉素（批号：S1054）、氧氟沙星（批号：S1049）、诺氟沙星（批号：S1047）、恩诺沙星（批号：S1081）、新霉素（批号：S1034）、四环素（批号：S1036）、多西环素（批号：S1037）；头孢唑啉标准品购自广东省药品检验所，效价99.3%；培养基购自广东省环凯微生物科技有限公司。实验用品均在有效期内使用。
1.3 试验方法
1.3.1 原代葡萄球菌12种抗生素的药敏试验
按NCCLS（美国临床和实验室标准协会）推荐的Kirby-Bauer琼脂扩散法药敏试验测定12种抗生素对实验菌株的敏感程度[3]。挑单个菌落至液体培养基培养12 hr后，校正菌液浓度至0.5麦氏比浊度。均匀涂布于平板表面，然后将纸片贴于琼脂平板表面，37°C培养18～24 hr后测抑菌圈，选出较敏感药作为诱导抗生素（头孢唑啉）。
1.3.2 原代葡萄球菌最小抑菌浓度（MIC值）的测定
用96孔微量肉汤稀释法测定MIC[5]。挑单个菌落接于液体培养基，37℃培养18～24 hr后稀释10倍制成菌悬液。将头孢唑啉标准品配成浓度为512 μg/mL的头孢唑啉药液，然后倍比稀释获得多浓度梯度药液。将稀释的药液与制成的接种悬液按1：9的比例分别加入10个浓度梯度药的孔中，药浓度逐孔递减；第11孔加100 μL营养肉汤作阴性对照，第12孔加100 μL稀释的菌悬液作阳性对照，37°C孵育
18～24 hr观察结果。
1.3.3 头孢唑啉体外诱导原代葡萄球菌耐药
根据MIC的测定结果，取最小抑菌浓度下一浓度孔的菌液（实际药物浓度为0.1 μg/mL），按菌液：头孢唑啉药液：普通营养肉汤1：1：8比例混合接种至试管，于37°C培养24 hr，连续传代，逐步提升药液浓度，每隔10～20代测定敏感度。传至第55代，实际诱导的药物浓度为51.2 μg/mL，初步定义为耐药菌。
1.3.4 耐药菌耐药性的测定
1.3.4.1 测定耐药菌对原来12种抗生素的敏感性
方法参照1.3.1[3]。平板上挑取耐药菌的单个菌落至液体培养基培养12 hr后，校正菌液浓度至0.5麦氏比浊标准。均匀涂布接种于平板表面，均匀将含药纸片贴于含菌平板表面，37°C培养箱培养18～24 hr后測量抑菌圈。
1.3.4.2 测定耐药菌的最小抑菌浓度（MIC值）
方法参照1.3.2[5]。稀释的10个浓度梯度药液分别加到无菌96孔板中，然后将稀释的药液与制成的耐药菌接种悬液按1：9的比例分别加入10个浓度梯度的10孔中，药物浓度逐孔递减，浓度最高为51.2 μg/mL；第11孔加100 μL普通营养肉汤作为阴性对照，第12孔加100 μL稀释后的耐药菌接种悬液作为阳性对照，37°C培养18～24 hr观察结果。
2 结 果
2.1 耐药葡萄球菌形态学变化
耐药菌株普通营养琼脂平板菌落细小，稍白；耐药菌株在甘露醇NaCl琼脂平板上平板颜色浅黄，形态与原代菌一致。加头孢唑啉药液培养的菌液革兰氏染色油镜镜检形态松散，黏着度低，极少或不形成葡萄串状。菌落革兰氏染色油镜镜检与典型葡萄球菌形态一致。
2.2 原代与耐药葡萄球菌12种抗生素药敏实验结果与相关变化
多次药敏试验结果，原代葡萄球菌对12种抗生素均敏感，诱导的耐药菌株对所测的β-内酰胺类药物的完全耐药，同时发现耐药菌对所测非β-内酰胺类原先敏感的药物的敏感度增加。
2.3 原代与耐药葡萄球菌最小抑菌浓度（MIC值）测定结果及变化
测定MIC的实验菌株设为第一代，第二代开始用头孢唑啉对菌株体外人工诱导。研究发现，每次提升药物浓度，实验菌株逐步适应环境，生长速度由慢变快。传至第55代，实际药物浓度为51.2 μg/mL，获得完全耐药的葡萄球菌菌株。测得头孢唑啉对耐药菌株的MIC值
3 讨 论
目前研究一般认为“超级”细菌的耐藥性形成可能与用药剂量、用药频度与宽度（使用药物的频率与种类的多少）、细菌的自身变异（物理、化学、生物性的变异）等有关。本实验，经过55代的体外多步传代诱导，成功诱导出耐药葡萄球菌。在自然环境下，细菌长期接触低剂量的一种或多种抗生素的可能性是比较小的。说明葡萄球菌在自然环境下对头孢唑啉是不太容易产生耐药性的。本方法所需仪器设备少，能较好解决操作难度和成本的问题且诱导效率、准确率和成功率比较好。本实验方法申请的发明专利申请已经受理。
本实验诱导的耐药菌株对所测β-内酰胺类抗生素均由敏感变成完全耐药、对所测非β-内酰胺类抗生素敏感度增加，喹诺酮类抗生素氧氟沙星、诺氟沙星和恩诺沙星的抑菌圈分别从30、24、26 mm升至35、30、35 mm，四环素类抗生素四环素和多西环素的抑菌圈分别从26、21 mm升至35、30 mm，氨基糖苷类抗生素新霉素的抑菌圈从19 mm升至
33 mm，糖肽类抗生素万古霉素的抑菌圈从16 mm升至
23 mm。其中新霉素的抑菌圈增加最多，敏感度升高最为明显，其次是恩诺沙星和四环素。
根据目前的研究，耐药性机制分为：细菌产生灭活酶或钝化酶，破坏抗生素的结构，使其失去活性；改变抗生素作用的靶位蛋白结构和数量，使细菌对抗生素不再敏感；细菌细胞膜渗透性改变，使抗生素不能进入菌体内部；细菌主动药物外排泵作用，将抗生素排出菌体；细菌生物被膜的形成，降低抗生素作用等[1-9]。而该耐药菌的耐药机制及对非β-内酰胺类抗生素敏感度增加的原因尚不清楚，有待进一步深入研究。
通过本实验说明低剂量药物多次体外诱导可以诱导葡萄球菌产生对β-内酰胺类抗生素的完全耐药；但该耐受菌株却大大增加了对其他类抗生素的敏感性。同时在此呼吁临床应合理使用抗生素。
参考文献
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本文编辑：赵小龙
