梅为云+李娜+刘录+陈继坤+黄靳翔+高汪荣+周志宏
【摘要】利用回流提取法对不同采收期的云南甜柿叶进行预处理，采用高效液相色谱法测定样品中山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷的含量。提取条件为提取溶剂50%乙醇，液固比30∶1，提取3次，提取时间90 min；液相色谱条件为采用ZORBAX Eclipse XDB-C18 （250 mm×46 mm， 5μm）色谱柱分离，甲醇-04%磷酸溶液为洗脱系统进行梯度洗脱，检测波长265 nm；三种黄酮的相对标准偏差均小于1%，平均回收率均在99%以上。该方法具有较好的分离效果和较高的稳定性，适用于用来分析不同采收期的云南甜柿叶中上述三种黄酮的含量，测定结果表明三种黄酮在叶中积累具有规律性，随柿果实成长不断积累，并且果实成熟时达到最高。
【关键词】甜柿；高效液相色谱法； 山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷；山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷；槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷
【中图分类号】R2842【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2017）08-0020-04
Abstract：A HPLC method was developed for determinating the contents of Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside， Kaempferol-3-O-β-D-galactopyranoside， and Quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside in the leaves of Yunnan Diospyros kaki in different harvest periods. The HPLC elution was carried out using methanol-04% phosphate system at a flow rate of 10 mL/min， the injection volume was 10 μL， and the detector wavelength was set at 265 nm. The RSD values of the three flavonoids were all less than 1% and the average recoveries were all above 99%. This method showed good separation effect and high stability， and could be used for determining the contents of the three flavonoids in the leaves of Yunnan Diospyros kaki in different harvest periods. The result showed that the accumulation of them in leaves of Yunnan Diospyros kaki exhibited regularity， and the contents were increasing along with fruit growing.
Keywords： Diospyroskaki；HPLC；Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside；Kaempferol-3-O-β-D-galactopyranoside；Quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside.
柿子為柿树科（Ebenaceae）柿树属（Diospyros）植物柿Diospyros kaki的果实，是我国五大水果（葡萄、柑橘、香蕉、苹果、柿子）之一[1]。近年来在各地均有大面积种植，市场上也出现了多种资源再利用的深加工产品。柿叶是大规模种植后产生的可持续利用资源，因其富含多种活性成分和营养成分而倍受关注 [2-4] 。云南是甜柿水果规模化种植大省，甜柿叶资源的综合利用尚处于起步阶段，黄酮类成分是其主要功效成分[5]，目前对柿叶中总黄酮的提取工艺研究[6-8]，以及黄酮含量的测定[9-11]的文献较多。但同时检测柿叶中3种常见功效黄酮山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷（1） [12]、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷 （2） [13]和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷 （3） [14]尚属首次，具有一定的现实意义。本实验建立了一种HPLC色谱检测方法，用于检测不同采收期新鲜柿叶中三种黄酮类物质的含量，并分析其在叶中积累的规律性，为合理利用柿叶提供科学依据。
1仪器与材料
11仪器岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪（日本岛津公司）；TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；DHG-9240A型恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；SB-2000 EYELA旋转蒸发仪（上海爱郎仪器有限公司）；AL204型分析天平（梅特勒-托利多上海有限公司）。
12材料不同采收期的新鲜柿叶均有昆明石林绿汀甜柿产品开发有限公司提供；山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷 （1）、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷 （2）和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷 （3） （纯度均≥999%）为实验室自制，经包括核磁共振、质谱等多种波谱学鉴定。甲醇（色谱纯）、乙醇（分析纯）购于天津市风船化学试剂科技有限公司；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。
2方法
21样品溶液的提取黄酮多为极性成分，易溶于醇和水中，为便于工业化生产，本工艺采用常规的乙醇水为溶剂进行回流提取。设计不同溶剂比例，溶剂倍量（液固比）、提取时间、提取次数四因素三水平L9（34）正交实验进行工艺参数优化 （见因素水平表1），考察指标为提取物中1～3质量之和（K1），据此得到最佳提取条件，提取溶剂为50%乙醇，液固比为30∶1，一次提取时间为90min，提取次数为3次。详见表1。
22对照品溶液的配制分别取山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷（1）、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷（2）和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷（3），置于干燥器中于室温（25℃）下干燥12 h，精密称定各化合物，用甲醇配制成单品对照品溶液和混合对照品（质量比1∶1∶1）溶液。
23样品溶液的配制将不同采收期的新鲜柿叶自然晒干后于50℃下烘干至恒重，粉碎后过60目筛，称取10000g，按照“21”中的提取方式，将三次过滤收集的滤液合并，用旋转蒸发仪在70℃下减压浓缩，甲醇定容至25mL，经045μm膜过滤，待测。
24色谱条件色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18 （250 mm×46 mm，5 μm）；检测器：紫外检测器；检测波长：265nm；柱温30℃；甲醇-04%磷酸溶液为洗脱系统。见表2。
3结果与分析
31单因素分析
311乙醇浓度的选择选取40%～100%的乙醇以10%为1个梯度，来考察3种黄酮的得率。发现用50%乙醇提取时，得率最高，故提取溶剂选择50%的乙醇水溶液。
312液固比的选择精密称取等量的干燥柿叶的样品，分别按照液固比（体积：质量）为20∶1、30∶1、40∶1条件下加入50%乙醇水，各提取30min，经抽滤、浓缩、定容，取适量过045μm滤膜，进行HPLC测定，结果表明液固比在30∶1时得率较大，综合考虑选取液固比为30∶1。
313提取时间的选择精密称取等量的干燥柿叶样品，按液固比30∶1用50%乙醇水提取，提取时间分别为30、60、90 min，经抽滤、浓缩、定容，取适量过045 μm滤膜，进行HPLC测定。结果表明3提取时间为90min时得率较高，故提取时间选择为90min为宜。
314提取次数的选择按照311、312、313中优选的方法，根据以上思路最后确定提取次数3次为宜；4次时，得率与3次基本没有变化。
32正交实验在单因素实验的基础上，选取影响三种黄酮得率的乙醇浓度，液固比，提取时间，提取次数四因素，设计四因素三水平的L9（34）正交实验来进行工艺参数优化，正交实验结果及分析见表3。
由表3可见，以K1为指标时，适宜的提取工艺为A2B1C3D3，与正交实验分析所得最佳工艺条件一致，所以选择A2B1C3D3为提取柿叶中黄酮的适宜提取工艺条件，即提取溶剂为50%乙醇，液固比为30∶1，每次提取时间为90min，提取次数为3次。
33色谱分离参数的确定
331检测波长的确定采用双光束紫外可见分光光度计对化合物1～3进行扫描，1～3均在265nm附近有最大吸收。故选择检测波长为265nm进行检测。
332流动相的确定为了获得较好的分离度，参照文献的报道，本实验选取了6组不同的流动相系统进行比较：乙腈-水，乙腈-1‰磷酸水溶液，乙腈-04‰磷酸水溶液，甲醇-水，甲醇-1‰磷酸水溶液，甲醇-04‰磷酸水溶液。分别对不同采收期的柿叶中三种黄酮的含量进行测定，通过比较各化合物的分离度、保留时间和峰形，最终选用甲醇-04‰磷酸水溶液系统。见表2。
34对照品和样品溶液的色谱分离图取供试样品溶液适量，参照上述液相方法进行HPLC分析，记录谱图1。供试品中三种黄酮的色谱峰分离度及峰形均较好，符合高效液相色谱定量分析的一般要求。化合物1～3的保留时间分别为4714、3639、2448 min，均与单独分析时保留时间一致。
35线性关系、定量限及检出限的考察精密称取化合物1～3的质量，分别配制成浓度为1370 μg/mL，613 μg/mL和1239 μg/mL的标准液，用甲醇对其进行不同倍数的稀释，经HPLC分析，以对照品的峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果见表4所示。三种黄酮在各自的线性范围内线性关系良好，线性相关系数均达到0999以上。
取各单品对照品溶液，用甲醇稀释后进行HPLC分析，调整溶液浓度得出信噪比为3和10时，即可得样品的最低检出限和定量限，结果见表4。
36精密度及稳定性实验取适量已经配制好的混合对照品溶液，过滤后进行HPLC分析，连续进样6次，化合物1～3三种对照品相对标准偏差RSD分别为026%、059%和019%，表明仪器精密度良好。
37重复性实验取同一供试品溶液，平行测定6次，考察HPLC测定的重复性，三种黄酮的RSD分别为095%，089%和078%，符合要求。
38稳定性实验取同一供试品溶液，据实验验所得条件，于0、2、4、8、12、18、24h进样测定，结果表明，三种黄酮的RSD分别为084%、080%和068%，符合要求。说明供试品溶液在24h内稳定。
39加样回收率实验取已知含量的供试品9份，精密加入1～3对照品，按实验所得方法测定，结果表明，该分析方法回收率9768～10033%，平均回收率9887%，RSD值为100%；9208～10156%，平均回收率9672%，RSD值为331%；9136%～10011%，平均回收率9518%，RSD值为320%。故该方法可以满足分析测试的要求。
310不同采收期的柿葉中三种黄酮含量的测定按照前面的方法，对不同采收期的甜柿叶13批样品进行三种黄酮含量的测定，结果见表5。从表5中可以看出，9月、10月采收的柿叶，三个黄酮的含量均高。
4讨论
通过对云南甜柿叶中黄酮提取工艺的研究，适宜的提取工艺条件：提取溶剂50%乙醇，液固比30∶1，提取3次，提取时间90min。云南甜柿叶中三种黄酮1～3高效液相色谱分析条件：ZORBAX Eclipse XDB-C18 （250 mm×46 mm， 5 μm）色谱柱分离，甲醇-04%磷酸溶液为洗脱系统进行梯度洗脱，检测波长265 nm；三种黄酮的相对标准偏差均小于1%，平均回收率均在99%以上。
通过对不同采收时间的甜柿叶进行三种黄酮成分的测定表明，三种黄酮在叶中的积累具有规律性：随着柿叶采收不断积累，至9月、10月份达到最高值，随后开始降低，即随着果实成长不断累积，果实成熟时达到最高。因此，对柿叶黄酮的利用可以在果实成熟后采摘同时进行，一方面不影响果实采收，另一方面提高柿叶的综合利用效率。参考文献
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（收稿日期：2017-02-23编辑：梁志庆）
