卢雪花 孙凤灵 李丽莎
【摘 要】 目的：建立一种基于内部转录间隔区2（ITS 2）序列突变位点鉴别建泽泻的焦磷酸测序方法。方法：分别提取建泽泻与川泽泻的须根、叶片、叶柄DNA，采用焦磷酸测序方法进行分析鉴定，并通过毛细管电泳测序验证方法的正确性。结果：建立了一种基于ITS 2序列焦磷酸测序鉴定方法，经毛细管电泳测序验证结果准确可靠。建泽泻ITS 2序列中的突变位点A-T的突变频率均不小于83%。结论：焦磷酸测序方法可以准确鉴定不同基源的泽泻物种。
【关键词】 焦磷酸测序；建泽泻；鉴定；ITS 2
【中图分类号】R286.0 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2018）16-0026-03
Abstract：Objective Establish a pyrosequencing method based on the ITS 2 sequence mutation sites to identify Alisma orientalis. Methods DNA was extracted respectively from roots， leaves and petiole of Alisma orientalis and analyzed by pyrosequencing. The correctness of the method was verified by capillary electrophoresis sequencing. Results A pyrosequencing method based on the ITS 2 sequence was established. This method was verified by capillary electrophoresis sequencing to be accurate and reliable. The mutation frequency from A to T site was not less than 83% in the ITS 2 sequence of Alisma Orientalis. Conclusion Pyrosequencing can accurately identify Alisma species from different sources.
Keywords：Pyrosequencing； Alisma Orientalis； Identification； ITS2
泽泻为多年沼生泽泻科植物泽泻Alisma orientalis （Sam.）Juzep.的干燥块茎，最早历史记载可追溯到《神农本草经》。其性寒味甘，有泄热、利水渗湿、化浊降脂的功效[1]，主要有利尿[2]、降血糖[3-5]，降血脂[6-9]等活性。泽泻主产福建、四川、江西等地，素有“建泽泻”、“川泽泻”、“江泽泻”之称，以建泽泻、川泽泻量大且使用广泛，其中又以建泽泻质佳，被载入中国的道地药材。目前主要采用性状鉴别和化学成分分析对泽泻进行鉴定，该方法鉴定结果主观性较强，准确性无法得到保证。焦磷酸测序技术（Pyrosequencing） 是一种基于酶催化反应的新一代测序技术，其精确性和可重复性高，并能够实时、直观地提供序列信息，同时能定性定量分析差异碱基。该技术利用生物素标记一条扩增引物，扩增产物无需荧光标记与电泳分离，因此操作更为简便、快捷。本实验采收福建省建瓯建泽泻药材，同时以川泽泻作为对照药材（采自四川省眉山），采用焦磷酸测序方法鉴定其基源，为今后泽泻的质量控制研究奠定基础。
1 仪器与材料
1.1 儀器 PCR仪（美国Bio-Rad）；高速离心机（德国eppendorf）；生物安全柜（青岛海尔特种电器有限公司）；超微量核酸/蛋白分析仪（英国Biochrom）；数显恒温水浴锅（江南仪器厂）；电泳仪（六一仪器厂）；暗箱式紫外投射仪（上海顾村电光仪器厂）；实时定量焦磷酸测序仪（凯杰生物工程有限公司）；恒温孵育器（德国eppendorf）。
1.2 材料 建泽泻药材采自福建省建瓯吉阳镇，川泽泻药材采自四川省眉山市彭山区谢家镇，经福建省医学科学研究院徐榕青研究员鉴定为泽泻科植物泽泻。分别取建泽泻与川泽泻的须根、叶柄及叶片样本。
1.3 试剂 Binding Buffer、Denaturation Solution、Wash Buffer、annealing buffer、PyroMark Gold Q 24 Reagents均购自凯杰生物工程有限公司；2×EasyTaqPCRSuperMix（AS111-14）购自北京全式金生物技术有限公司；十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、乙二胺四乙酸（EDTA）购自美国BIOSHAPR；三羟甲基氨基甲烷、琼脂糖购自美国NOVON；其余试剂均为国产分析纯；实验引物由铂尚生物技术公司合成。
2 方法
2.1 DNA提取 采用的改良CTAB法分别提取建泽泻、川泽泻的须根、叶柄及叶片DNA。
2.2 PCR扩增 25μL PCR扩增体系中包含有1μL DNA模板（约50～100ng），12.5μL 2×Taq PCR MasterMix，10μmol/L上下游引物各1μL（引物序列见表1），用ddH2O补足至25μL。扩增条件为94℃-5min；（94℃-30s，58℃-30s，72℃-45s）×30 cycle；72℃-5min；扩增产物保存于4℃。
2.3 焦磷酸测序 取5μL PCR产物、1μL的beads、40μL bingding buffer，补足MQ至80μL，25℃1400rpm振荡孵育10min。经变性和洗涤后，使未标记生物素的DNA单链与已标记单链分离，将含有beading的反应板于80℃孵育2min后冷却至室温。试剂仓中加入所需的酶、底物和dNTP等进行检测。
2.4 测序验证 中药材DNA条形码鉴定系统中查询所得ITS2序列上游引物：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，下游：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。PCR扩增条件为94℃-5min；（94℃-30s，56℃-30s，72℃-45s）×30 cycle；72℃—10min；扩增产物于4℃保存。未经纯化的PCR产物送铂尚生物技术有限公司测序。
3 结果与分析
3.1 焦磷酸测序结果 采用焦磷酸测序技术进行SNP分析。根据ITS2位点突变情况，得两种峰图，建泽泻（含须根、叶柄、叶片）突变位点碱基为A（如图1所示），川泽泻（含须根、叶柄、叶片）突变位点碱基为T（如图2所示），二者突变频率均不小于83%（见表2）。
3.2 测序验证结果 测序序列与下载序列见表3，同时由图3可以看出，建泽泻ITS2序列与东方泽泻一致，与泽泻存在A-T突变；川泽泻ITS2序列与泽泻一致，与东方泽泻存在A-T突变。有研究表明东方泽泻与泽泻在ITS2序列上的A-T变异是稳定突变，因此可准确鉴定这两个物种[10]。故可判断建泽泻与东方泽泻基源一致，即Alisma orientalis （Sam.）Juzep.
4 讨论
实验采用焦磷酸测序技术对ITS2突变位点进行研究，发现建泽泻与川泽泻在突变位点碱基不同，且毛细管电泳测序技术进一步验证了这一结果，说明焦磷酸测序结果的准确性，因此本实验建立的基于ITS2突变位点的焦磷酸鉴定技术能准确鉴定不同产地的泽泻物种。与直接测序法相比，焦磷酸测序所用DNA不需要经过凝胶电泳纯化和荧光标记，测序过程中可对测序结果实时观察，同时能定性定量分析差异碱基，灵敏度高，操作便捷，适合已知序列的DNA短片段测序，是一种适用于中药材的分子生物学鉴定手段。
参考文献
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（收稿日期：2018-06-08 编辑：程鹏飞）
