朱凤娇 潘连连 王传捷 叶军辉
[摘要] 目的 探讨支气管肺泡灌洗液腺苷脱氨酶（ADA）及T细胞亚群在肺结核诊断中的应用价值。 方法 选取2015年1月～2017年1月我院30例肺結核患者为观察组，另选取同期就诊的肺部良性病变患者30例为对照组。两组患者均行支气管肺泡灌洗，收集支气管肺泡灌洗液检测ADA及T淋巴细胞亚群。观察并比较两组患者的肺泡灌洗液ADA及T淋巴细胞亚群的差异。 结果 观察组患者支气管肺泡灌洗液ADA含量明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；观察组患者支气管肺泡灌洗液T淋巴细胞CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平明显低于对照组，CD8+水平明显高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。 结论 肺结核患者免疫功能低下，检测支气管肺泡灌洗液ADA及T淋巴细胞亚群能为临床诊断肺癌提供依据，具有较高的临床应用价值。
[关键词] 肺结核；支气管肺泡灌洗液；腺苷脱氨酶；T淋巴细胞亚群
[中图分类号] R521 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2017）36-0124-04
[Abstract] Objective To investigate the application value of bronchoalveolar lavage fluid adenosine deaminase and T cell subsets in the diagnosis of pulmonary tuberculosis. Methods 30 patients with pulmonary tuberculosis from January 2015 to January 2017 were selected as the observation group. 30 patients with benign lung lesions in the same period were selected as the control group. Two groups of patients underwent bronchoalveolar lavage. The ADA and T lymphocyte subsets in the bronchoalveolar lavage fluid were collected. The differences of ADA and T lymphocyte subsets in the alveolar lavage fluid were observed and compared between the two groups. Results The ADA content of bronchoalveolar lavage fluid in the observation group was significantly higher than that in the control group， and the difference was significant（P<0.05）. The levels of CD3+， CD4+， CD4+/CD8+ in T lymphocytes of bronchoalveolar lavage fluid in the observation group were significantly lower than those in the control group， and CD8+ level in the observation group was significantly higher than that in the control group， and the difference was statistically significant（P<0.05 or P<0.01）. Conclusion Tuberculosis patients have low immune function. The detection of ADA and T lymphocyte subsets in bronchoalveolar lavage fluid can provide the basis for clinical diagnosis of lung cancer， and have high clinical application value.
[Key words] Tuberculosis； Bronchoalveolar lavage fluid； Adenosine deaminase； T lymphocyte subsets
肺结核是临床常见的呼吸道传染病，有研究显示全球有近1/3的患者感染过结核分枝杆菌，我国是结核病高发区域，患病率高、死亡率高[1-3]。早期诊断与治疗是改善肺结核患者预后的关键，找到结核杆菌是诊断肺结核的金标准，但临床上痰菌阴性的肺结核患者占总患者的65%～75%[4，5]。支气管肺泡灌洗术（bronchoalveolar lavage，BAL）是运用支气管镜对支气管以下肺段或亚肺段水平，反复以无菌生理盐水灌洗、回收，获得支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），从病原微生物学、分子生物学、免疫学、细胞学及酶学等角度检测分析BALF性质，近年来逐渐应用于早期诊断肺结核的诊断及治疗中[6-8]。本研究通过检测腺苷脱氨酶（adenosine deaminase，ADA）及T细胞亚群，探讨其对肺结核的诊断价值，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2015年1月～2017年1月期间在我院就诊的肺结核患者共30例为观察组。纳入标准：根据痰液检查抗酸杆菌、病理学特征、影像学检查等确诊为肺结核。排除标准：（1）合并其他肺部疾病；（2）合并严重的循环系统、消化系统、血液系统疾病；（3）不愿接受支气管肺泡灌洗检测。其中男16例、女14例；年龄54～76岁，平均（63.7±5.7）岁。选取同期在我院门诊就诊的肺部良性病变患者30例作为对照组，其中男18例、女12例，年龄46～75岁，平均（64.3±6.1）岁，按肺部疾病分：慢性阻塞性肺疾病16例、支气管扩张8例、肺炎6例。两组患者在年龄构成、性别分布等方面比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究方案经我院伦理委员会批准通过，纳入的患者均知情同意，并签署知情同意书。
1.2 检测方法
两组患者均在局麻下行支气管镜检查，支气管镜使用日本Olympus BF-1T-240型纤维支气管镜，根据影像学定位的病变部位，将支气管镜置于病变部位，使用生理盐水进行灌洗，总量约为100 mL，使用50～100 mmHg负压回收灌洗液约50 mL，30 min内送检支气管肺泡灌洗液。将灌洗液过滤，去除黏液与杂质，采用1500 r/min离心约10 min，使用RP-MI 1640培养液清洗后悬浮于加入10%小牛血清的培养液中，在37℃培养箱中培养1 h。采集细胞，使用抗CD3+、抗CD4+、抗CD8+、单克隆抗体进行染色后使用美国BD FACSCalibur流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群。使用酶联免疫吸附法检测腺苷脱氨酶（ADA），全自动生化分析仪使用美国雅培7170型，所需试剂盒均采购自瑞士罗氏公司，操作程序严格按照试剂盒所附的说明书进行实验操作。
1.3 观察指标
观察并比较两组患者的肺泡灌洗液ADA及T淋巴细胞亚群的差异，其中T淋巴细胞亚群包括CD3+（68%～77%）、CD4+（41%～51%）和CD8+（23%～30%）水平以及CD4+/CD8+（1.4～2.0）的比值。
1.4 统计学方法
采用SPSS17.0 for windows统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，各项数据服从正态分布，组间比较采用成组t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组患者支气管肺泡灌洗液中的ADA含量比较
观察组患者支气管肺泡灌洗液中ADA含量明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.2 两组患者支气管肺泡灌洗液T淋巴细胞亚群水平比较
观察组患者支气管肺泡灌洗液中的T淋巴细胞CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平明显低于对照组，CD8+水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。见表2。
3 讨论
肺结核是由结核分枝杆菌引发的肺部感染性疾病，是严重威胁人类健康的疾病。结核分枝杆菌的传染源主要是排菌的肺结核患者，通过呼吸道传播。健康人感染结核菌并不一定发病，只有在机体免疫力下降時才发病。世界卫生组织（WHO）统计表明，全世界每年发生结核病800～1000万，每年约有300万人死于结核病，是造成死亡人数最多的单一传染病。1993年WHO宣布“全球结核病紧急状态”，认为结核病已成为全世界重要的公共卫生问题[9]。我国是世界上结核疫情最严重的国家之一，近年来肺结核的发病率呈上升趋势。肺结核如不及时治疗，致死、致残率高，早期诊断与治疗是改善患者预后的关键[10]。但肺结核病理变化较为复杂，临床及影像学表现变化多样，缺乏特异性，很难与其他肺部良性疾病鉴别[11]。痰中找到结核分枝杆菌是诊断肺结核的金标准，但痰菌阳性率很低，很难为临床诊断肺结核提供依据，而目前实验室常用的血清结核抗体、C反应蛋白、血沉等辅助检查特异性差，因此临床早期诊断肺结核困难重重[12]。
结核分枝杆菌感染人体的致病原因尚不明确，但近年来有研究发现其与免疫功能密切相关，ADA是嘌呤核苷代谢重要的酶类，每分子中含有2个以上的活性巯基，其由活化的T淋巴细胞产生，在单核细胞的成熟过程中起着总要的作用[13-15]。T淋巴细胞是介导细胞免疫的重要因子，其包括辅助性T淋巴细胞CD3+、CD4+和细胞毒性淋巴细胞CD8+，其中辅助性T淋巴细胞具有杀伤肿瘤的作用，而细胞毒性T淋巴细胞能分泌免疫抑制因子，具有抑制效应性T细胞活化的作用[16-17]。检测ADA与T淋巴细胞对于肺结核的诊断价值受到关注，但与之相关的报道较少。
60年代后期随着可曲性光纤维支气管镜的开发和应用，逐渐兴起支气管肺泡灌洗。自1974年Reynolds和Newball报道支气管肺泡灌洗技术以来，为研究某些肺疾病，特别是某些间质性肺疾病，如结节病、特发性肺纤维化、过敏性肺泡炎、肺泡蛋白沉积症、胶原血管病伴间质性肺疾病、组织细胞增多症、尘肺、肺损伤与修复和免疫受损患者的肺部感染等疾病，开辟了一个新的研究途径和检测手段，有学者甚至将支气管肺泡灌洗液称为“液体肺活检”[18-26]。对于在涂阴、无痰、标本获取困难而又急需抗结核治疗的肺结核患者，运用各种技术检测支气管肺泡灌洗液中结核分枝杆菌或相关成份有利于疾病的诊断与鉴别诊断，为早期抗结核治疗提供病原学依据[28-31]。因此，本次研究采用检测肺结核支气管肺泡灌洗液中ADA与T淋巴细胞的水平，研究结果显示观察组支气管肺泡灌洗液ADA含量明显高于对照组，差异有统计学意义。我们考虑这与肺结核患者细胞免疫反应有关，肺结核是一种慢性的炎症性反应，患者会出现大量的T淋巴细胞与单核细胞发生浸润、活化和转变成为巨噬细胞，ADA是该过程中重要的酶，会在此过程中发挥重要的作用，因此肺结核患者肺泡灌洗液中的ADA会出现明显的升高。本研究还发现观察组支气管肺泡灌洗液T淋巴细胞CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平低于对照组，CD8+水平高于对照组。我们考虑这与肺结核患者免疫功能低下密切相关，而T淋巴细胞亚群的变化能够充分反应结核患者的细胞免疫状态与免疫调节情况，结核患者的T淋巴细胞表达受到抑制，机体的免疫应答也出现了抑制，因此CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平较正常明显下降。
总之，肺结核患者免疫功能低下，检测支气管肺泡灌洗液ADA及T淋巴细胞亚群能为临床诊断肺癌提供依据，具有较高的临床应用价值。本研究未对其他肺部疾病患者肺泡灌洗液ADA与T淋巴细胞亚群水平进行检测，也未对肺结核患者治疗后的支气管肺泡灌洗液进行检查，需要进一步研究加以完善。
[参考文献]
[1]Grange JM，Stamford JL.Dogma and innovation in the global control of tuberculosis：Discussion paper[J]. J Roy Soc Med，1994，87（5）：272-275.
[2]Yoo H，Song JU，Koh WJ，et a1.Additional role of second washing specimen obtained during single bronchoscopy session in diagnosis of pulmonary tuberculosis[J]. BMC Infect Dis，2013，13（3）：404-406.
[3]Cakir E，Kut A，Ozkaya E，et a1.Bronchoscopic evaluation in childhood pulmonary tuberculosis：Risk factors of airway involvement and contribution to the bacteriologie diagnosis[J]. Pediatr Infect Dis J，2013，32（8）：921-923.
[4]Goussard P，Gie R.The role of bronchoscopy in the diagnosis and management of pediatric pulmonary tuberculosis[J].Expert Rev Respir Med，2014，8（1）：101-109.
[5]Bonella F，Bauer PC，Griese M，et al.Pulmonary alveolar proteinosis：New insights from a single-center cohort of 70 patients[J].Respir Med，2011，105（12）：1908-1916.
[6]張宏英，陈力舟，林敏，等.痰与支气管肺泡灌洗液结核分枝杆菌FQ-PCR检测对涂阴肺结核诊断价值的比较[J].中国防痨杂志，2011，33（12）：806-809.
[7]Lee HY，Seong MW，Park SS，et al.Diagnostic accuracy of Xpert MTB/RIF on bronchoscopy specimens in patients with suspected pulmonary tuberculosis[J]. Int J Tuberc Lung Dis，2013，17（7）：917-921.
[8]Le Palud P，Cattoir V，Malbruny B，et al. Retrospective observational study of diagnostic accuracy of the Xpert MTB/RIF assay on fiberoptic bronchoscopy sampling for early diagnosis of smear-negative or sputum—scarce patients with suspected tuberculosis[J]. BMC Pulm Med，2014， 14（2）：137-139.
[9]Zhang Ling. New thinking of the diagnosis of tuberculosis（TB） and control of drug-resistant TB[J]. Clinical Focus，2014，29（6）：601-604.
[10]He Jieming，Yu Tao，Li Lan.Value of detection of ADA and LDH in bronchocalveolar lavage fluid on the diagnosis of tuberculosis（TB）[J]. Chinese Hygiene System Management（CHSM），2015，6（29）：145-147.
[11]Jin Meiyu. Clinical value of the combination detection of adenosine deaminase（ADA） and tumor marker on the differential diagnosis of lung cancer and tuberculosis（TB）[J].Guide of China Medicine，2014，12（35）：226-227.
[12]Dang Liyun，Fan Yu，Pang Jianjian. Analysis of three combination detection on the diagnosis value of tuberculosis （TB）[J]. Shanxi Medical Journal，2001，30（3）：144-145.
[13]夏铵冬.支气管肺泡灌洗液腺苷脱氨酶对肺结核诊断的临床价值探讨[J].中国实用医药，2014，9（3）：30-31.
[14]Zhu LJ，Zhu CP，Yang XJ. ADA，CRP and CEA in the diagnosis of pleural effusion[J]. Journal of Clinical Pulmonary Medicine，2009，14（3）：313-314.
[15]李慧竹，兰秀聪，刘五高. 腺苷脱氨酶对肺炎支原体肺炎的辅助诊断作用[J]. 中国现代医生，2012，50（1）：88-89.
[16]Reiley WW，Shaflani S，Wittmer ST，et al.Distinct functions of antigen specific CD4 T cells during murine myco-bacterium tuberculosis infection[J].Proc Nat Acad Sci USA，2010，107（45）：19408-19413.
[17]Wei Jing，Zhang Jixue，Cui Tingting，et al. Detection of T-cells subsets in bronchocalveolar lavage fluid of patients with tuberculosis（TB）[J]. Modern Medicine Journal，2012，14（8）：7-9.
[18]Waiters E，Goussard P，Bosch C， et a1. GeneXper MTB/RIF on bronchoalveolar lavage samples in children with suspected complicated intrathoracic tuberculosis：A pilot study[J]. Pediatr Pulmonol，2014，49（11）：1133-1137.
[19]Theron G，Peter J，Meldau R，et al.Accuracy and impact of Xpert MTB/RIF for the diagnosis of smear-negative or sputum—scarce tuberculosis using bronchoalveolar lavage fluid[J]. Thorax，2013，68（11）：1043-1051.
[20]吳国兰，陈晓红，李学玲，等. 4种不同支气管肺泡灌洗液结核杆菌检测方法在肺结核诊断中的应用研究[J]. 中国临床医生，2013，41（3）：39-41.
[21]Arrieta O，Nunez-Valencia C，Reynoso-Erazo L，et al. Health. related quality of life in patients with lung cancer：Validation of the Mexican-Spanish version and association with prognosis of the EORTC QLQ-LCI3 questionnaire[J].Lung Cancer，2012，77（1）：205-211
[22]唐神结，肖和平，范以虎，等.肺结核患者支气管肺泡灌洗液中某些细胞因子与受体的检测及其临床意义[J]. 中华传染病杂志，2009，27（3）：167-171.
[23]Nolan A，Fajardo E，Huie ML，et al.Increased production of IL-4 and IL-12 p40 from bronchoalveolar lavage cells are biomarkers of Mycobacterium tuberculosis in the sputum[J]. PLoS One，2013，8（3）：e5946-e5952.
[24]Yoo H，Song JU，Koh WJ，et al.Additional role of second washing specimen obtained during single bronchoscopy session in diagnosis of pulmonary tuberculosis[J]. BMC Infectious Diseases，2013，13（1）：404-407.
[25]Meyer KC. The clinical utility of bronchoalveolar lavage in interstitial lung disease-is it really useful[J]. Expert Rev Respir Med，2014，8（2）：133-135.
[26]葛启隆，林春龙.支气管肺泡灌洗液在间质性肺疾病中的应用进展[J].医学综述，2017，23（4）：7080-712.
[27]Hashemian SM，Mortaz E，Tabarsi P，et a1. Elevated CXCL-8 expression in bronchoalveolar lavage correlates with disease severity in patients with acute respiratory distress syndrome resulting from tuberculosis[J]. J Inflamm（Lond）， 2014，11（1）：21-23.
[28]Kurashima K，Mukaida N，Wujimura M，et a1. Elevated chemokine levels in bronchoalveolar lavage fluid of tuberculosis patients[J]. Am J Respir Crit Care Med，1997， 155（4）：1474-1477.
[29]张晶，邓群益，高杨，等.实时荧光定量聚合酶链反应检测支气管肺泡灌洗液中结核分枝杆菌 DNA 对肺结核的诊断价值[J].临床肺科杂志，2009，14（3）：337-339.
[30]彭文锋，陈玲.支气管肺泡灌洗液检测在肺结核研究及临床应用中的进展[J].贵州医药，2016，40（1）：100-102.
[31]谭玲玲，何振华，张秀峰.经支气管镜刷检“激惹”后支气管肺泡灌洗液检查对支气管结核的诊断意义[J].临床肺科杂志，2011，16（5）：718-719.
（收稿日期：2017-09-13）
