丁雨钦 邹德宏 何向明
[摘要] 外泌体是一类由自体细胞分泌的纳米级囊泡样小体，参与细胞及内环境之间的物质运输和信号传递。外泌体可以通过在肿瘤细胞和细胞外基质间运输细胞内的核酸、蛋白和脂类等物质，影响肿瘤的发生和发展，甚至可以影响肿瘤的治疗。不同类型的肿瘤细胞分泌的外泌体，在肿瘤的发生过程中发挥着不同的作用。近来，与乳腺癌相关的外泌体逐渐成为一项新的研究热点，并发现乳腺癌细胞可以刺激分泌某些特定类型的外泌体，并有望成为早期乳腺癌筛查的新型生物学标志。外泌体传递的核酸、蛋白质等物质在乳腺癌的发生、转移和治疗耐药中起到了重要作用。同时外泌体也可以将抗肿瘤药物转运出乳腺癌细胞导致耐药。但外泌体作为肿瘤药物载体时，表现出极低的免疫原性和生物毒性，将为今后的肿瘤靶向治疗提供可行的技术基础。
[关键词] 外泌体；乳腺癌；肿瘤转移；药物耐受；肿瘤微环境；生物学标记
[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）19-0159-05
[Abstract] Exosomes are a kind of nanoscale vesicle-like body secreted by autologous cells， which are involved in the transport and signal transmission between cells and internal environment. Exosomes can affect the occurrence and development of tumors and can even affect the treatment of tumors by transporting intracellular substances including nucleic acids， proteins and lipids between tumor cells and extracellular matrix.Exosomes secreted by different types of tumor cells play different roles in the process of tumorigenesis. Recently， breast cancer-related exosomes have gradually become a new research hot spot and it is found that breast cancer cells can stimulate the secretion of certain types of exosomes， which are expected to become a new biological marker of early breast cancer screening. Substances including nucleic acids and proteins transferred by exosomes play an important role in the occurrence of breast cancer， metastasis and treatment of drug resistance.Meanwhile， exosomes can also transported anti-tumor drugs out of breast cancer cells to lead to drug resistance. However， when exosomes are used as tumor drug carriers， they exhibit very low immunogenicity and biotoxicity， and will provide a viable technical basis for future targeted tumor therapy.
[Key words] Exosomes； Breast cancer； Tumor metastasis； Drug tolerance； Tumor microenvironment； Biological markers
乳腺癌作為一类女性多发恶性肿瘤，在中国地区的发病率达到25.89/10万，约占所有女性恶性肿瘤发病率的16.83%。目前对于乳腺癌的临床诊断方法主要包括：临床体检、影像学检查、血清肿瘤标志物等，但这些检查手段的特异性和敏感性往往都不能令人满意，容易导致漏诊早期的乳腺癌，这也成为导致乳腺癌患者预后不良的重要因素之一。为寻找一些敏感可靠的诊断标志物，近年来关于乳腺癌的分子生物学研究逐渐成为热门。
膜泡运输是细胞内外的一类物质转运方式，在运输过程中细胞膜常以囊泡的形式，包裹蛋白、核酸、多糖等多类物质参与转运。而其中由多种活细胞自体分泌的外泌体（Exosomes，EXs）就是一类囊泡小体，包含核酸、RNA及蛋白质等物质。研究指出异常的外泌体物质转运与肿瘤的发生关系密切，在乳腺癌的形成、复发、转移甚至化疗药物耐药的过程中均有参与[1]。本文就近年来关于外泌体对于乳腺癌的发生发展、肿瘤的诊断以及治疗意义等方面作一综述。
1 外泌体
外泌体是一类由多种细胞分泌的多形性囊泡样小体，直径约40～100 nm[2]，广泛存在并分布于各类体液中，如血液、尿液、唾液、渗出液甚至羊水，且有较高浓度。这类体内广泛存在的纳米级囊泡结构小体可参与细胞之间或与内环境之间的物质、信息传递，在多种生理和病理过程中发挥着重要作用。不同组织部位细胞分泌的外泌体在其内容物的组成和功能均有相应的区别，学者认为这种生物学差异受到其所处的细胞外环境的调控[3]。
外泌体由蛋白质、RNA和少量脂类分子构成。其中蛋白质是外泌体内含物的主要部分：Annexins、Alix、Flotillin、Rab家族蛋白和TSG101（tumor susceptibility gene101）等参与膜泡融合和运输过程；蛋白激酶、G-蛋白等作为信号分子存在；CD9、CD63等跨膜区蛋白质超家族成员与外泌体的生成相关；另外还包括分泌来源细胞的特异性蛋白等[4]。由肿瘤细胞产生的外泌体中，人们还发现了如FasL、TRAIL（TNF related apoptosis inducing ligand）和TGF-β（transforming growth factor-β）等肿瘤抗原和免疫抑制蛋白。肿瘤来源的外泌体包含高浓度的microRNA（miRNA），可以参与肿瘤的自身调控。同时，外泌体保护细胞外RNA的稳定，并且能将mRNA和miRNA运送至其他细胞或组织中发挥调控作用。在卵巢癌、神经胶质瘤、肺癌、结肠癌等恶性肿瘤相关研究中均有提及并检测到外泌体中包含的蛋白分子或miRNA[5]。
2 早期诊断的新型生物学标志物
目前临床对于乳腺癌的诊断多依赖于临床体检、影像学、血清肿瘤标志物以及病理学证据。其中乳腺癌的生物标记物大致可分为3类：（1）组织学标记：如雌激素（estrogen receptors，ER）、孕激素（progesterone receptors，PR）、人类表皮生长因子-2（human epidermal growth factor-2，HER-2）、p53、Ki-67等[6]；（2）血清学标记：如CEA、CA153、CA549-muc-1家族、MCA（Anti-Microsomal antibodv）、BR27、29等，但特异性都不是很高；（3）基因型标记：有着相对较高的特异性和敏感性。
Zhang L等[7]提出通过检测唾液中包含的外泌体可以对早期的乳腺癌、口腔癌、胰腺癌等恶性肿瘤做出准确诊断。文献中指出由乳腺癌细胞分泌的外泌体（Exosomes derived from breast cancer，Exo-BCa）在由唾液腺细胞分泌后，其蛋白、RNA等内容物会发生蛋白组学和转录组学的改变进而出现高表达。故笔者认为外泌体所包含的蛋白质和miRNA可作为一类重要的基因型标记，在对乳腺癌的早期诊断有着十分重要的作用。
3 参与乳腺癌的发生
既往研究认为肿瘤的发生起源于具有自我更新能力的肿瘤干细胞，这类细胞往往可以促进肿瘤的增殖并向不同类型分化[8]。如乳腺癌干细胞可以导致乳腺癌的发生，并引起后续的肿瘤增殖、浸润和转移。在乳腺癌的发生过程中，外泌体通过影响肿瘤周围血管的生成促进肿瘤的发生和增殖，并且往往受到体内组织含氧量、乙酰肝素酶等其他因素的调控影响[9]。
研究发现Exo-BCa可以导致癌周正常乳腺细胞的增殖并减少细胞凋亡。同时Clayton A等[10]发现，这一类外泌体可以通过调节与免疫逃避反应相关的NKG2D（natural-killer group 2，member D）受体，抑制机体的免疫反应。实验中当乳腺癌相关外泌体与外周血淋巴细胞共同培养时，NKG2D阳性的细胞数量减少，所以认为T型淋巴细胞的减少也许是导致乳腺癌细胞逃避机体免疫识别和攻击的原因之一。
在高含量的乙酰肝素酶作用后的乳腺癌细胞中提取外泌体，后者被证实可以促进肿瘤的增殖和血管生成，导致肿瘤细胞的转移[11]。
另外还有研究认为，外泌体可以通过影响肿瘤微环境促进肿瘤的转化并参与肿瘤各个时期的发生过程[12-14]。
4 涉及乳腺癌的浸润和转移
通常人们认为肿瘤的浸润和转移是肿瘤细胞及其微环境共同作用的结果。其中肿瘤微环境的成分主要包括：基质间细胞、细胞外基质、可溶性因子、机械信号（如外泌体）以及相对缺氧的组织环境[15]。其中基质间细胞多为纤维母细胞、血管生成以及免疫相关细胞。可溶性因子多包括：生长因子、激素、细胞因子和趋化因子等[16-17]。微环境中的这些成分可以帮助肿瘤细胞逃避宿主免疫反应、形成药物耐药，进而促进肿瘤的转移[18]。
King HW等[19]研究证实，组织缺氧的环境可以促进乳腺癌细胞释放外泌体，在相对缺氧的乳腺癌细胞中，高含量的外泌体导致肿瘤的进一步增长。乳腺癌外泌体在与人乳腺上皮细胞（HMEC）的相互作用下，可以引起ATM（ataxia telangiectasia mutated）、H2AX（histone family member X）、Chk1（checkpoint kinase 1）和p53的磷酸化，間接地促进了肿瘤的生长。
Singh R等[20]发现在乳腺癌MDA-MB-231细胞株中miRNA-10b呈过表达状态，增强了乳腺癌的侵袭性，并且细胞株中提取的外泌体可以增加正常乳腺上皮细胞的侵袭性。
Suetsugu A等[21]通过裸鼠乳腺癌模型，将外泌体用荧光蛋白标记后发现，乳腺癌细胞产生的外泌体可以被传送至其他的肿瘤细胞和正常的肺组织细胞中，阐明了在乳腺癌原发灶和转移灶之间外泌体的转运过程。经过乳腺癌外泌体作用后，脂肪组织中的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）可以通过Smad通路被转变为肌成纤维细胞[22]，而后者参与肿瘤血管和蛋白结构的重建，成为肿瘤细胞转移的一类重要因素。Luga V等[23]发现纤维母细胞释放的外泌体可以通过Wnt-细胞平面极性信号通路（Wnt planar cell polarity signaling pathway），增强乳腺癌细胞的生物学活性，说明来源于微环境中肿瘤基质部位的外泌体同样在乳腺癌的转移中起重要作用。Zhou W等[24]认为外泌体介导转运的miR-105可以破坏血管内皮层的完整性，使细胞间的联接紧密性下降，肿瘤血管渗透性增加，导致乳腺癌转移的发生。
5 导致乳腺癌治疗耐受的绊脚石
治疗耐受一直是乳腺癌治疗中的难题。多项研究结果提示乳腺癌治疗耐受是多种因素联合作用的结果：肿瘤干细胞可能与乳腺癌患者的放疗耐受相关[25-26]，肿瘤相关的miRNA、蛋白质和细胞传导通路异常都可以导致乳腺癌的化疗耐药[27-28]，而HER-2阳性患者出现靶向药物赫赛汀的治疗耐受，可能与肿瘤成纤维细胞有关，后者通过上调肿瘤干细胞的增殖，并同时激活多种信号通路导致治疗耐药。
外泌体通过在肿瘤细胞和基质细胞间转运也会影响治疗效果。Boelens MC等[29]认为外泌体经NOTCH3通路从细胞外基质向肿瘤细胞传递信号，上调干扰素相关DNA损伤耐受的信号，同时增强NOTCH靶基因的转录，通过增加乳腺癌细胞治疗耐受的区间最终引起化疗和放疗耐受。Eldh M等[30]认为慢性的缺氧条件可刺激外泌体的释放，DNA损伤修复通路被改变，引起DNA错误修复或遗传不稳定性，也是导致放疗耐受的原因之一。Chen WX等[31]通过研究已出现耐药的Exo-BCa，发现外泌体可以通过转运P-gp和miRNA引起耐药现象。Lv MM等[32]从对多西他赛耐药的乳腺癌细胞株MCF-7中提取外泌体（DOC/exo），将其作用于药物敏感型MCF-7细胞株（MCF-7/S），结果发现MCF-7/S同样会出现耐药反应，同时MCF-7/S中的P-gp表达量上升且与外泌体浓度呈正相关，提示对多西他赛耐药的乳腺癌细胞通过释放包含P-gp的外泌体，可以引起其他乳腺癌细胞的耐药。Shedden K等[33]认为药物外排机制，即细胞摄取的抗肿瘤药物被外泌体或其他囊性小泡包裹后运出细胞外的过程，也是导致药物耐药的原因之一。
6 乳腺癌治疗的新途径
目前乳腺癌的临床治疗方法主要包括手术、化疗、放疗、内分泌治疗和靶向药物治疗，但治疗效果因个体反应差异较大，多受限于患者在治疗过程中出现的毒副反应、治疗耐受等情况，所以亟需展望新的治疗方法。
外泌体是自体分泌的纳米级膜性囊泡样结构，其免疫原性和毒性都极低[34]。Tian Y等[35]发现经纯化后的外泌体通过电穿孔转染可以携带阿霉素，通过小鼠未成熟的树状细胞分泌后靶向作用于乳腺癌细胞。另有文献报道，表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）来源的外泌体可以有效抑制肿瘤相关的巨噬细胞浸润和M2型巨噬细胞极化，进而抑制乳腺恶性肿瘤的增大[36-37]。外泌体还可以破坏肿瘤生长的微环境从而影响肿瘤的生長。经姜黄素预处理的乳腺癌外泌体可以翻转组织中被抑制的NK细胞活性，因此认为外泌体可以转运抗癌药物或活性因子，重启机体免疫系统。在体外实验中，经腺病毒载体转染的树突状细胞释放的外泌体，可以激活针对于HER2的细胞毒性T淋巴细胞，逆转对曲妥珠单抗药物的耐药[38]，为曲妥珠单抗药物耐药的患者提供了一个新治疗选择。
但是目前外泌体在临床应用中仍有障碍，如较难获取大量治疗用量的外泌体以及人工改造后的外泌体如何输入人体用于治疗。
7 结论和展望
外泌体是纳米级的囊性小泡结构，其功能主要是通过传递一些miRNA、蛋白质等物质进行细胞内外的信息交换和传输，起到调控细胞及其肿瘤生物学行为的作用。越来越多的研究结果证实，在肿瘤的发生发展过程中外泌体起到十分重要的作用。外泌体可以作为包括乳腺癌在内的多种肿瘤的生物标记物存在，在恶性肿瘤中分泌的外泌体，其内容物的含量和种类有别于正常乳腺细胞。对于乳腺癌的治疗，外泌体也可能是一类潜在的药物载体。
本文中，笔者复习外泌体在体外作为乳腺癌的靶向药物载体文献，但目前仍没有关于外泌体可以用于人体内药物载体的相关文献报道。我们也总结外泌体在目前研究中在乳腺癌的发生、发展过程中所起的重要作用。在后续研究中，将进一步探讨外泌体在乳腺癌中的作用机制，以及探寻新的治疗方法，为将来药物载体研究提供新的研究思路。
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（收稿日期：2017-03-21）
