任鹏宇 关亚新 张婷婷
[摘要] 目的 探讨西洋参茎叶皂苷（PQS）对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用与炎症反应之间的关系。方法 SD大鼠120只，随机分为5组，对照组、模型组、西洋参茎叶皂苷（50、100、200 mg/kg）组，采用大脑中动脉阻塞法制备大鼠脑缺血再灌注损伤模型。缺血再灌24 h后检测大鼠神经功能损伤评分；干湿重法测定脑含水量；生化法检测脑组织髓过氧物酶（MPO）的活性；ELISA 法检测大鼠脑组织及血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）的含量。结果 西洋参茎叶皂苷（100、200 mg/kg）组可明显减轻缺血再灌注大鼠脑神经功能损伤和脑水肿程度，降低缺血脑组织MPO的活性，降低缺血脑组织和血清TNF-α和IL-6的含量。结论 西洋参茎叶皂苷可通过降低TNF-α 和IL-6炎性细胞因子的表达，减缓炎症反应，减轻脑水肿，降低大鼠脑神经功能损伤程度，进而对脑缺血再灌注损伤起到一定的保护作用。
[关键词] 缺血再灌注；西洋参茎叶皂苷；炎症；肿瘤坏死因子α
[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）19-0033-03
[Abstract] Objective To explore the relationship between the protective effect of panax quinquefolium saponins （PQS） on focal cerebral ischemic injury in rats and the inflammatory reactions. Methods 120 SD rats were randomly divided into 5 groups，control group， model group， PQS groups（50， 100， 200 mg/kg）. A model of cerebral ischemia-reperfusion injury was established by middle cerebral artery occlusion. The score of rats' neurological impairment was measured 24 hours after ischemia reperfusion； brain water content was measured by dry and wet weight method； the activity of myeloperoxidase（MPO） in brain tissue was detected by biochemical method. The levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6） in rats' brain tissues and serum were measured by ELISA. Results PQS （100， 200 mg/kg） could significantly reduce the degree of cerebral nerve impairment and cerebral edema in the rats with ischemia-reperfusion injury， decrease the activity of MPO in ischemic brain tissue， and lower the contents of TNF-α and IL-6 in ischemic brain tissue and serum. Conclusion Panax quinquefolium saponins（PQS） can slow the inflammatory reactions， alleviate cerebral edema and reduce the degree of neurological impairment in rats by decreasing the expression of TNF-α and IL-6 inflammatory cytokines， and then exert a protective effect on cerebral ischemia-reperfusion injury.
[Key words] Ischemia reperfusion； Panax quinquefolium saponins （PQS）； Inflammations； Tumor necrosis factor-α
西洋參茎叶皂苷（PQS）是由西洋参茎和叶中所提取的主要活性成分，具有增强免疫力、抗肿瘤、抗氧化、抗心肌缺血损伤等广泛的生物活性[1]。近年研究发现[2-3]，PQS对脑缺血损伤具有保护作用，但具体机制仍未完全明确，尤其是其关于抗炎机制的报道相对较少。因此，本实验采用大脑中动脉阻塞法制备大鼠脑缺血再灌注损伤模型，观察PQS对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用，研究其保护作用机制与炎症反应之间的相互关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康SD大鼠50只，清洁级，雄性，体重280～330 g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK（京）2012-0001]。所有大鼠给予常规饲料饲养，自由饮水和摄食，保持室内安静，日照12 h，室温保持在 20℃～25℃，相对湿度控制在40%～60%。
1.2 药品与试剂
西洋参茎叶皂苷由吉林大学基础医学院有机化学教研室提供，纯度>90%；TNF-α和IL-6 ELISA试剂盒均由欣博盛生物科技有限公司提供。
1.3 给药与分组
SD大鼠按体重随机被分为以下5组：（1）对照组；（2）缺血再灌注模型组；（3）PQS治疗组（50、100、200 mg/kg）组，每组10只。PQS治疗组于模型制备前每天灌胃给药1次，连续灌胃7 d。对照组和模型组均灌胃给予相同容积的生理盐水。
1.4 采用 Longa 线栓法[4]加以改进制备大脑中动脉缺血再灌注损伤模型
大鼠以10%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉后，固定于手术台，颈部采用左旁中切口，暴露左侧颈总（CCA）、颈内动脉（ICA）和颈外动脉（ECA），并钝性分离，ECA结扎后于其分叉处剪一0.2 mm切口，将直径为0.245 mm、头端制成直径约为0.34 mm光滑圆球的尼龙线自切口处经颈内、颈外动脉分叉部进入颈内动脉，遇轻微阻力时停止推入，插入深度约为17～20 mm，扎紧并固定线栓，缺血2 h提拉栓线至颈总动脉内进行再灌注。术后以电热毯保暖使大鼠直肠体温维持在（37±0.5）℃。对照组仅分离血管，并把尼龙线插入颈总动脉1 cm左右，不达到大脑中动脉位置。
1.5 神经功能损伤评分
动物苏醒后放回笼内，自由饮食，脑缺血再灌注24 h后根据Longa的5分法对大鼠进行神经功能障碍评分。0分：无神经功能障碍；1分：右前爪不能充分外展；2分：行走时朝右转圈；3分：行走时朝右倾倒；4分：不能自主行走，伴意识障碍[5]。选取神经功能损伤评分为1～3分大鼠用于以下实验，每组各6只。
1.6 干湿重法行脑含水量测定
缺血再灌注24 h后，大鼠迅速断头取脑。用滤纸吸除缺血侧脑皮质表面的残血，电子天平精确称其湿重，然后将脑组织置于105℃常压恒温烘箱中，烘烤至恒重水平，電子天平精确称其干重。采用如下公式：脑组织含水量（%）=（脑组织湿重-脑组织干重）/脑组织湿重×100%，计算脑组织含水量。
1.7 脑组织髓过氧化物酶（MPO）活性测定
各组大鼠在缺血再灌注24 h后，迅速断头，取大鼠缺血侧额顶叶皮层脑组织100 mg，用试剂盒提供的介质溶液将大鼠脑组织制成 10%的匀浆液，严格按照检测试剂盒说明书步骤进行操作，计算脑组织MPO活性。
1.8 脑组织及血清TNF-α和IL-6含量测定
各组大鼠在缺血再灌注24 h后，心脏取血3～5 mL，于4℃ 2000 r/min条件下离心10 min，取血清并放置于-80℃冰箱保存；各组大鼠在缺血再灌注24 h后迅速断头，用加冰生理盐水将缺血侧皮层脑组织制成10%的匀浆液，于4℃条件下离心10 min，吸取上清保存于-80℃冰箱；按照ELISA试剂盒说明书操作步骤检测脑组织及血清样品中TNF-α和IL-6的含量。
1.9 统计学处理
结果采用 SPSS 17.0 统计学软件分析处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间资料统计采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 PQS对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能障碍的影响
对照组大鼠无神经功能损伤障碍表现；脑缺血再灌注24 h 后，模型组大鼠均表现出不同程度的神经功能缺损症状，相比对照组，模型组大鼠神经功能损伤评分明显增高（P<0.01），提示造模成功；与模型组相比，PQS（100、200 mg/kg）剂量组可明显降低大鼠神经功能损伤评分（P<0.05）。见表1。
2.2 PQS对缺血脑组织含水量的影响
与对照组比较，模型组大鼠缺血脑组织含水量明显增高，差异具有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，PQS高剂量组可明显降低大鼠脑组织含水量，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.3 PQS对缺血脑组织MPO活性的影响
模型组大鼠缺血脑组织中MPO 活性明显高于对照组（P<0.01）；PQS（100、200 mg/kg）剂量组可明显降低缺血脑组织MPO活性，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.4 PQS对缺血脑组织TNF-α和IL-6含量的影响
模型组大鼠脑组织TNF-α和IL-6的含量较对照组均明显升高（P<0.01，P<0.05）；相比模型组，PQS（100、200 mg/kg）剂量组均可明显降低缺血脑组织TNF-α和IL-6的含量，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表2。
2.5 PQS对大鼠血清TNF-α和IL-6含量的影响
模型组大鼠血清TNF-α和IL-6的含量较对照组均明显升高 （P<0.01）；相比模型组，PQS（100、200 mg/kg）剂量组均可明显降低血清TNF-α和IL-6的含量，差异具有显著性（P<0.05）。见表3。
3 讨论
既往研究提示在缺血再灌注脑损伤的生理病理发展过程中炎症反应起着非常重要的作用[6-7]。缺血再灌注发生后，神经胶质细胞、中性粒细胞等炎性细胞被激活，血脑屏障由于内皮细胞炎症反应而受到损伤，从而引发脑水肿，形成缺血与炎性反应之间的恶性循环。脑缺血后释放多种炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素 6（IL-6）、白介素1β（IL-1β）、白介素10（IL-10）等均参与以上病理生理学反应过程，从而促进脑缺血性损伤向炎症性损伤发生转变[8-9]。实验研究发现，阻断脑缺血再灌注引发的炎症应答过程对脑组织具有一定的保护作用[10-11]。因此，通过抑制炎症反应、减轻神经细胞的损伤可成为防治脑缺血再灌注损伤的一个重要策略。
本实验采用大鼠局灶性缺血再灌注脑损伤模型模拟临床脑缺血损伤病理变化，观察发现PQS可减轻脑缺血再灌注大鼠神经功能损伤、抑制脑水肿，这与以往研究结果一致[12]，提示PQS对大鼠脑缺血再灌注损伤具有一定程度的保护作用。此外，研究发现，PQS（100、200 mg/kg）剂量组可明显降低缺血脑组织MPO活性（P<0.05）。位于中性粒细胞嗜天青颗粒中的MPO，可作为中性粒细胞的特异性标记物，其活性可评价中性粒细胞在组织中的浸润程度及组织炎症反应的程度[13-14]。本研究观察结果提示PQS可减轻由脑缺血再灌注损伤所诱导的炎症反应。
TNF-α主要由活化的单核巨噬细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元分泌产生，是体内最为重要的炎症介质之一。研究表明在脑缺血早期即出现TNF-α表达水平上调高，其可激活炎性细胞、诱导IL-6、IL-1β等多种细胞因子的表达，从而促进神经细胞的凋亡、坏死和脑水肿的形成，TNF-α在腦缺血早期分泌或合成的增加是脑梗死形成的主要原因[15-16]。IL-6在脑缺血损伤中的作用机制复杂，具有保护和损伤双重作用。IL-6在正常生理状态下，其血清表达水平很低，具有保护和修复神经元的作用；IL-6在脑缺血后的急性损伤期，其表达量迅速升高，可导致神经元的破坏及内皮细胞、胶质细胞的损伤。IL-6作为缺血性脑损伤急性期严重程度的重要标志，可受TNF-α、IL-1β的调控，进而参与机体的炎症和免疫反应[17-18]。因此，抑制炎性因子TNF-α、IL-6等的合成、分泌及表达，减轻神经细胞缺血性损伤可成为减轻缺血再灌注脑损伤的一项重要策略。在本研究结果中TNF-α和IL-6在对照组大鼠血清和脑组织中的含量均较低，而模型组大鼠血清和脑组织中TNF-α和IL-6的含量均显著升高，且TNF-α与IL-6的含量变化趋势基本一致，也提示二者在脑组织发生缺血再灌注损伤后具有协同作用。PQS（100、200 mg/kg）剂量组均可明显降低缺血再灌注损伤后大鼠血清和脑组织中TNF-α和IL-6的含量，提示PQS可通过抑制炎性细胞因子减轻炎症反应，进而减轻缺血性脑损伤。
综上所述，PQS可通过调节炎症性细胞因子TNF-α和IL-6的合成及分泌，减缓炎性反应，抑制脑水肿，减轻缺血大脑神经功能损伤程度，进而对大鼠缺血再灌注脑损伤产生保护作用。
[参考文献]
[1]薛燕，闻莉.西洋参根及茎叶皂苷提取物中12种主要皂苷成分的分析研究[J].药物分析杂志，2009，29（1）：79-81.
[2]关利新，翟凤国，聂影，等.西洋参茎叶皂苷对脑缺血大鼠细胞凋亡及caspase-3表达的影响[J].中药药理与临床，2008，24（1）：30-32.
[3]王怀刚，关利新，赵鑫，等.西洋参茎叶皂苷对局灶性脑缺血后大鼠血清中GFAP 表达的影响[J].中医药学报，2011，4（39）：17-19.
[4]Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20（1）：84-91.
