米洋 原小斌 张彬 王东文 张旭辉
[摘要] 目的 探討2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠前列腺微血管新生与良性前列腺增生症发生发展的关系。 方法 ①正常对照组大鼠（Normal组，n=15）：8～10周龄正常雄性Wistar大鼠；②单纯良性前列腺增生组大鼠（BPH组，n=15）：手术去势后外源性给予高剂量雄激素；③胰岛素抵抗前列腺增生组大鼠（GK+BPH组，n=15）：8～10周龄自发型非肥胖型2型糖尿病Wistar大鼠（GK大鼠），手术去势后外源性给予高剂量雄激素；④胰岛素抵抗前列腺增生血糖干预组大鼠（GK+BPH+PH组，n=15）：8～10周龄GK大鼠手术去势后外源性给予高剂量雄激素，同时给予盐酸吡格列酮灌胃。光化学法检测大鼠空腹血糖水平；ELISA双抗体夹心法检测大鼠血清胰岛素水平及前列腺DHT含量；real-time PCR法检测大鼠前列腺VEGF、Ang-1、Ang-2 mRNA表达量；免疫组化S-P法检测前列腺组织CD31表达并根据阳性结果计数MVD。 结果 ①GK+BPH、GK+BPH+PH组空腹血糖水平及胰岛素抵抗指数高于Normal组及BPH组（P<0.05）；GK+BPH组指标高于GK+BPH+PH组（P<0.05）；Normal组及BPH组上述指标差异无统计学意义（P>0.05）。BPH组、GK+BPH组、GK+BPH+PH组前列腺组织中DHT含量与Normal组相比明显增高（P<0.05）；GK+BPH组、GK+BPH+PH组高于BPH组，且GK+BPH组高于GK+BPH+PH组（P<0.05）；②各组前列腺组织中VEGF、Ang-1、Ang-2 mRNA表达量及MVD计数结果为GK+BPH组>GK+BPH+PH组>BPH组>Normal组，组间差异有统计学意义（P<0.05）；③GK+BPH组、GK+BPH+PH组大鼠前列腺组织中DHT含量与胰岛素抵抗指数呈正相关（P<0.05），相关性显著。 结论 2型糖尿病伴胰岛素抵抗时，可通过增加前列腺组织DHT的含量从而上调VEGF、Ang-1、Ang-2的表达，促进前列腺组织局部血管新生以加速良性前列腺增生症的进展。
[关键词] 胰岛素抵抗；前列腺增生症；血管内皮生长因子；血管生成素；微血管密度
[中图分类号] R691.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）08-0035-05
Experiment of microvascular angiogenesis of prostate in rats with insulin resistance
MI Yang1 YUAN Xiaobin2 ZHANG Bin2 WANG Dongwen2 ZHANG Xuhui2
1.First School of Clinical Medicine of Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China； 2.Department of Urology， First Hospital of Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China
[Abstract] Objective To investigate the association between the microvascular angiogenesis and the occurrence and progress of benign prostatic hyperplasia（BPH） in type-2 diabetic rats with insulin resistance（IR）. Methods ①Rats of normal group（n=15）： normal male Wistar rats aged 8 to 10 weeks. ②Rats of BPH group（n=15）： high-dose exogenous androgen was given after surgical castration. ③Rats with IR and BPH（GK+BPH） group（n=15）： high-dose exogenous androgen was given to spontaneous non-obese type-2 diabetic Wistar rats（GK rats） aged 8 to 10 weeks. ④Rats of IR and BPH with blood glucose intervened（GK+BPH+PH） group（n=15）： high-dose exogenous androgen was given to GK rats aged 8 to 10 weeks and pioglitazone hydrochloride was given by intragastric administration. The level of fasting blood glucose in rats was assessed by photochemical method. The levels of serum insulin and DHT in prostate of rats were assessed by double antibody sandwich ELISA. The expression of VEGF， Ang-1 and Ang-2 in prostate of rats was assessed by real-time. The expression of CD31 in prostate tissue was assessed by the S-P immunohistochemical method and MVD was counted based on the positive results. Results ①The level of fasting blood glucose and the IR index in GK+BPH group and GK+BPH+PH group were higher than those in normal group and BPH group（P<0.05）. Those in GK+BPH group were higher than GK+BPH+PH group（P<0.05） while there was no statistical difference between normal group and BPH group（P>0.05）. The level of DHT in the prostate tissue of BPH group， GK+BPH group and GK+BPH+PH group was higher than that in normal group（P<0.05）. That in GK+BPH group and GK+BPH+PH group was higher than BPH group and that in GK+BPH group was higher than GK+BPH+PH group（P<0.05）. ②The levels of mRNA of VEGF， Ang-1 and Ang-2 and the MVD count were： GK+BPH group>GK+BPH+PH group>BPH group>Normal group， with statistical differences between each other（P<0.05）. ③The level of DHT in the prostate tissue of GK+BPH group and GK+BPH+PH group was significantly and positively associated with the IR index（P<0.05）. Conclusion When IR occurred in type-2 diabetes， the level of DHT in prostate tissue could be increased to up-regulate the expression of VEGF， Ang-1 and Ang-2 and promote the microvascular angiogenesis in prostate tissue so as to accelerate the progress of benign prostatic hyperplasia.
[Key words] Insulin resistance； Prostatic hyperplasia； Vascular endothelial growth factor； Angiogenin； Microvessel density
雄激素是前列腺组织中重要的激素，目前研究认为其与良性前列腺增生症（benign prostatic hyperplasia，BPH）的发生发展密不可分[1]。前列腺血管内皮细胞是雄激素在前列腺组织中发挥生物学效应的主要靶点之一[2，3]，前列腺增生腺体中的血管过度生成可能与腺体的增生密切相关[4]。相关研究已证实，2型糖尿病合并胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）患者前列腺生长速度及前列腺体积与单纯BPH患者相比明显增高，但其具体机制尚未明确[5]。本研究通过构建2型糖尿病胰岛素抵抗合并BPH及单纯BPH大鼠模型，比较各模型组与正常大鼠前列腺组织中（dihydrotestosterone，DHT）、血管生成素-1（Angiopoietin-1，Ang-1）、血管生成素-2（Angiopoietin-2，Ang-2）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及微血管密度（microvessel density，MVD）计数差异，探讨2型糖尿病胰岛素抵抗与BPH发生发展的相关性。
1材料与方法
1.1 实验动物及饲养条件
2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠模型：使用8～10周龄，体重250～300 g，SPF级雄性非胰岛素依赖型非肥胖型2型糖尿病Wistar大鼠（GK大鼠），购自于江苏省常州市卡文斯实验动物有限公司，许可证号SCXK（苏）2011-003；其余各组选用同周龄SPF级雄性Wistar大鼠，购自于山西医科大学动物实验中心，许可证号：SYXK（晋）2003-013。所有大鼠均饲养于山西医科大学动物实验中心SPF级实验室，标准化饲养房喂养，饲喂标准颗粒饲料，自由饮水。饲养环境：T 18℃～22℃，H 50%～70%，日照时间为8：00-20：00。
1.2 主要试剂
盐酸吡格列酮（Sigma公司，PHR1632）；丙酸睾酮（Sigma公司，BP720）；苯甲酸雌二醇（Sigma公司，E8875）；大鼠胰岛素ELISA定量试剂盒（Thermo Fisher公司，ERINS）；大鼠DHT ELISA定量试剂盒（IBL公司，DB52021）；兔抗大鼠CD31单克隆抗体（R&D;公司，AF3628）；Real-time RT PCR试剂盒（Takara公司，RR037A）；罗氏活力型微量血糖仪及试纸。
1.3 方法
1.3.1 单纯BPH大鼠造模 8～10周龄Wistar大鼠行去势手术，术前8 h禁食，不禁水，取阴囊正中约1.5 cm横切口，分别游离左、右侧精索，自附睾头部近端结扎精索，切除双侧睾丸及附睾后还纳精索残端，逐层缝合切口。术后第3天起，每日皮下注射丙酸睾酮 3 mg/kg，苯甲酸雌二醇0.03 mg/kg，4周后诱导成模。
1.3.2 胰岛素抵抗合并BPH造模 8～10周龄GK大鼠随机验证空腹血糖≥8.0 mmol/L后，按照上述1.3.1中方法诱导BPH模型。
1.3.3 胰岛素抵抗合并BPH血糖干预组造模 8～10周龄GK大鼠随机验证空腹血糖≥8.0 mmol/L后，经口灌胃给予盐酸吡格列酮20 mg/（kg·d），并随即检测空腹血糖稳定≤6.5 mmol后，按照上述1.3.1中方法诱导BPH模型。
1.3.4 实验分组及给药方法 ①正常对照组大鼠（Normal组，n=15）：8～10周龄正常雄性Wistar大鼠；②单纯良性前列腺增生组大鼠（BPH组，n=15）：手术去势后外源性给予高剂量雄激素；③胰岛素抵抗前列腺增生组大鼠（GK+BPH组，n=15）：8～10周龄自发型非肥胖型2型糖尿病Wistar大鼠（GK大鼠），手术去势后外源性给予高剂量雄激素；④胰岛素抵抗前列腺增生血糖干预组大鼠（GK+BPH+PH组，n=15）：8～10周龄GK大鼠给予盐酸吡格列酮灌胃，同时行手术去势后外源性给予高剂量雄激素。
1.4 观察指标及方法
（1）大鼠空腹血糖测定：禁食8 h后鼠尾尖断尾采血，使用微量血糖仪测定。（2）胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）测定：采用鼠尾静脉取血，1000×g离心10 min后吸取上清，按照大鼠胰岛素ELISA定量试剂盒说明书操作，于450 nm波长下测定各标准品及样品吸光光度值，根据标准曲线及样品所测得的OD值，计算出相应Insulin含量。HOMA-IR=空腹血糖（FGP，mmol/L）×空腹胰岛素（FINS，mL U/L）/22.5。（3）大鼠前列腺组织中DHT测定：前列腺组织100 mg经液氮冷冻，加入1 mL 0.9% NaCl生理盐水，1000×g离心10 min后吸取上清，按大鼠DHT ELISA定量试剂盒说明书操作，于450 nm波长下测定各标准品及样品吸光光度值，根据标准曲线及样品所测得的OD值，计算出相应样本DHT含量。（4）大鼠前列腺组织Ang-1、Ang-2、VEGF检测：前列腺组织约100 mg，经液氮冷冻后研磨，加入1 mL Trizol提取总RNA，严格按试剂盒说明书方法首先反转录合成cDNA，通过SYBR Premix Ex TaqⅡ实时荧光定量PCR检测Ang-1、Ang-2、VEGF的表达，大鼠β-actin作为内参，应用ABI 7500荧光定量PCR进行检测。反应条件如下：①反转录 37℃ 15 min→85℃ 5 s→4℃；②Real time PCR stage 1预变性cycle 1 95℃ 30 s；stage 2 PCR反应cycle 40 95℃ 5 s→60℃ 30 s。real-time PCR引物见表1。（5）前列腺CD31检测并根据阳性结果计数MVD值：前列腺组织经10%中性福尔马林固定，脱水后石蜡包埋后切片，石蠟切片经脱蜡、复水后采用SP法免疫组化染色，3%过氧化氢浸泡10 min，山羊血清室温封闭10 min，加一抗CD31单克隆抗体4℃过夜孵育，加二抗及辣根过氧化物酶37℃孵育30 min，DAB显色，苏木素复染。各步骤间使用PBS冲洗，阴性对照使用PBS作为一抗。前列腺间质区成棕黄色染色的单个内皮细胞或内皮细胞簇，均作为一个血管计数，肌层较厚及管腔面积大于8个红细胞直经的血管不计数；每张染色切片首先在100倍视野下选择3个血管最多的前列腺间质区，其后在200倍视野下以CD31阳性表达血管结果进行MVD计数。每例标本分别随机计数5个视野，取平均值。
1.5 统计学方法
统计软件采用SPSS 22.0统计软件包，计量资料以（x±s）表示，各组之间比较采用单因素方差分析，采用Pearson相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠空腹血糖水平、胰岛素抵抗指数、前列腺组织DHT含量比较
与Normal组相比，GK+BPH组、GK+BPH+PH组空腹血糖水平比较明显增高（P<0.05），与BPH组空腹血糖水平比较差异不明显（P>0.05）；与GK+BPH组相比，GK+BPH+PH组空腹血糖水平降低（P<0.05）。
与Normal组相比，GK+BPH组、GK+BPH+PH组胰岛素抵抗指数明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），与BPH组胰岛素抵抗指数比较差异不明显，差异无统计学意义（P>0.05）；与GK+BPH组相比，GK+BPH+PH组胰岛素抵抗指数下降，差异有统计学意义（P<0.05）。
与Normal组相比，BPH组、GK+BPH组、GK+BPH+PH组大鼠前列腺组织中DHT含量明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）；与BPH组相比，GK+BPH组、GK+BPH+PH组大鼠前列腺组织中DHT含量增高，差异有统计学意义（P<0.05）；与GK+BPH组相比，GK+BPH+PH组大鼠前列腺组织中DHT值降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
2.2各组前列腺组织Ang-1、Ang-2、VEGF mRNA的表达及MVD计数比较
与Normal组相比，BPH组、GK+BPH组、GK+BPH+PH组大鼠前列腺组织中Ang-1、Ang-2、VEGF mRNA的表达均明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）；与BPH组相比，GK+BPH组、GK+BPH+PH组大鼠前列腺组织中Ang-1、Ang-2、VEGF mRNA的表达增高，差异有统计学意义（P<0.05）；与GK+BPH组相比，GK+BPH+PH组大鼠前列腺组织中上述三项指标的表达降低，差异有统计学意义（P<0.05）。
CD31主要表达于前列腺间质中血管内皮细胞膜及胞浆，表现为棕黄色颗粒。前列腺间质中各部分微血管管腔大小、分布密度差异性明显，以CD31阳性表达血管结果计数MVD（图1）。与Normal组相比，BPH组、GK+BPH组、GK+BPH+PH组大鼠前列腺组织中MVD值明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）；与BPH组相比，GK+BPH组、GK+BPH+PH组大鼠前列腺组织中MVD值增高，差异有统计学意义（P<0.05）；与GK+BPH组相比，GK+BPH+PH组大鼠前列腺组织中MVD值降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。
2.3大鼠胰岛素抵抗指数与DHT含量相关性分析
GK+BPH组大鼠胰岛素抵抗指数与DHT含量呈正相关，Pearson相关系数为0.716（P=0.014<0.05），相关性显著；GK+BPH+PH组大鼠胰岛素抵抗指数与DHT含量呈正相关，Pearson系数为0.737（P=0.002<0.05），相关性显著。
3 讨论
良性前列腺增生症（benign prostate hyperplasia，BPH）是我国中老年男性人群中常见的疾病，与之相关联出现的下尿路症状（lower urinary tract symptom，LUTS）包括尿频、尿急、尿流细线、夜尿增多等症状，严重影响着中老年患者的生活质量[6]。同时，随着近年来中国人群生活、饮食习惯的改变，2型糖尿病在我国中老年人群已成流行趋势[7]。相关临床研究发现，在合并有2型糖尿病胰岛素抵抗的BPH患者中，其前列腺体积增长速度高于单纯患BPH的患者[5]，但其机制目前尚不明确。在哺乳动物体内，雄性个体内的睾酮通过5α还原酶作用，转化为其活性形式——双氢睾酮（DHT），进而刺激前列腺组织的增生。Vikram[4]及Nandeesha等[8]认为胰岛素抵抗大鼠前列腺体积明显增大可能与前列腺组织中雄激素表达量增高从而促进BPH的发生发展密切相关。
雄激素在前列腺组织中发挥多种生物学效应，研究表明雄激素对前列腺血管内皮生长的促进作用是其在前列腺组织中所发挥的主要作用之一[9]。前列腺中血管內皮细胞对雄激素浓度变化极为敏感，予大鼠行去势手术后，可观察到前列腺组织中血管内皮细胞早于前列腺上皮出现凋亡[10，11]，外源性给予雄激素后，24 h内即可观察到前列腺血管内皮细胞的再生[2]。然而，雄激素并非直接促进前列腺血管内皮细胞的增殖，是通过调节血管内皮细胞或其他基质细胞所表达的血管相关生长因子含量，从而实现调控血管内皮细胞增殖[12]。
血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种强效的内皮细胞生长调控因子，可促进血管生成，现有研究已证明VEGF在前列腺的表达受雄激素含量变化的直接调控[13]。血管生成素（Angiopoietin，Ang）对诱导血管新生及稳定新生血管起重要作用，Ang-1与Ang-2具有相同受体Tie-2，Ang-1与受体结合后可引起新生血管结构重塑，降低新生血管通透性，稳定新生血管结构；Ang-2竞争性结合Tie-2受体后，可破坏血管内皮细胞-基质细胞-平滑肌细胞间的平衡，增加血管通透性，对抗Ang-1的血管稳定效应，促进血管新生[14，15]。Guimin Wang等[9]研究证明，雄激素通过调控前列腺组织中Ang-1、Ang-2的表达，从而上调VEGF的表达量，促进前列腺组织中血管的生成。MVD计数是目前公认评价血管生成的指标，通过应用血管内皮某些成分的单克隆抗体标记，如CD31、CD34等，进行免疫组化染色，可显示组织中的微血管，便于MVD计数。
