王洋 王斯斯 聂春
[摘要] 目的 对帕金森病患者的肠道菌群进行初步分析。 方法 收集2018年10月～2019年4月某三甲医院收治的7例帕金森病患者及7例健康对照者的粪便样本，提取菌群DNA，选取细菌16S rDNA的V3～V4区序列进行基因扩增及Illumina测序，生物信息学分析肠道菌群测序数据。 结果 Alpha多样性分析中，Chao指数、Ace指数、Shannon指数、Simpson指数在两组样本间无显著统计学差异（P>0.05）。在界、门分类水平上PD组及健康对照组物种数目相等，在纲、目、科、属、种、OTU分类水平上PD组所包含的物种数目依次高于健康对照组。受试样本中肠道菌群结构由4个主要的菌门组成，分别为厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门。在PD组中，检测到了12种显著升高的肠道菌群组分（P<0.05）。 结论 帕金森病患者与健康对照者的肠道菌群结构在大体上是相似的，有部分菌群在两组间存在着差异，深入分析肠道菌群变化有望为研究帕金森病的发病机制、疾病预防及治疗提供新思路。
[关键词] 帕金森病;肠道菌群;16S rDNA;菌群丰度
[中图分类号] R742.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2019）27-0054-04
[Abstract] Objective To preliminarily analyze the intestinal flora of patients with Parkinson's disease. Methods The stool samples of 7 patients with Parkinson's disease and 7 healthy controls admitted to a top three hospital from October 2018 to April 2019 were collected. The bacterial DNA was extracted. The V3-V4 region of bacterial 16S rDNA was selected for gene amplification and Illumina sequencing. The intestinal flora sequencing data was analyzed by bioinformatics. Results There were no significant differences in the Alpha diversity analysis， the Chao index， Ace index， Shannon index and Simpson index between the two groups（P>0.05）. The number of species in the PD group and the healthy control group were equal at the level of the boundary and the gate. The number of species contained in the PD group was higher than that of the healthy control group in the class， the order， the family， the genus， the species and the OTU classification level. The structure of the intestinal flora in the sample consists of four main fungi， namely the thick-walled fungus， the pseudobacteria， the proteobacteria and the actinomycetes.In the PD group， 12 significantly elevated intestinal floras were detected（P<0.05）. Conclusion The structure of intestinal flora in patients with Parkinson's disease and healthy controls is similar in some cases. Some of the bacteria are different between the two groups. In-depth analysis of intestinal flora is expected to provide new ideas for studying the pathogenesis， disease prevention and treatment of Parkinson's disease.
[Key words] Parkinson's disease; Intestinal flora; 16S rDNA; Bacterial abundance
帕金森病（Parkinson's disease，PD）是一種中枢神经系统退行性疾病，常见于中老年人群，目前全球有700万～1000万PD患者[1]。该病发病隐匿，呈慢性进行性发展，主要表现为静止性震颤、运动迟缓、姿势步态异常等症状。一些帕金森病患者还会出现便秘等胃肠动力异常表现，提示肠道菌群可能与帕金森病有一定的相关性[2]。现阶段研究中，将微生物作为生物标志物以分析慢性病的进展、靶向性调控菌群以改善疾病等，已经成为了基础及转化研究关注的热点。传统的细菌研究方法依赖于微生物培养和分离鉴定，但是绝大多数菌群无法在日常环境下通过传统手段获得。16S rDNA测序技术不需要对样本中菌群进行培养，而是直接对样本进行核酸提取，测定其所有微生物的核酸序列，这使得探索菌群构成差异、筛查病原体标志物成为可能。本研究基于16S rDNA测序的技术手段，对帕金森病患者及健康对照人群肠道菌群进行了初步分析，为探究帕金森病的病因及诊断治疗新靶标提供基础，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
研究纳入2018年10月～2019年4月某三甲医院收治的帕金森病患者7例，包含男4例、女3例，年龄54～67岁，平均（61.71±5.22）岁;健康对照者7例，包含男4例、女3例，年龄53～67岁，平均（61.86±5.93）岁。纳入标准：由专业的神经内科医生评估帕金森病患者的病情，诊断标准参照国际运动障碍协会2015年公布的帕金森病诊断标准[3]。健康对照组选择性别组成以及年龄和疾病组相匹配的受试者。排除标准：受试者无合并心血管疾病、内分泌疾病如糖尿病等慢性疾病。受试者采样前1个月内未服用抗生素、糖皮质激素等药物，采样前2周内未服用中草药制剂、微生态制剂、酸奶等。
1.2 主要仪器及试剂
Eppendorf离心机（Eppendorf，德国），-80℃超低温冰箱（Thermo，美国），ABI GeneAmpR 9700型PCR仪（ABI，美国），核酸电泳仪以及凝胶成像仪（BioRad，美国），Miseq测序仪（Illumina，美国）。QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit肠道菌群DNA提取试剂盒（QIAGEN，德国），TransStart Fastpfu DNA Polymerase PCR试剂（全式金生物，中国），AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（Axygen，美国），DL2000 DNAMarker（Takara，日本），MiSeqReagentKitsv3测序相关试剂（Illumina，美国）。
1.3 粪便标本采集
受试人员在医院用粪便收集器采集新鲜粪便样本2～3 g，迅速放入-80℃保存。
1.4 样本菌群DNA提取
采用肠道菌群DNA提取试剂盒QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit提取样本中的菌群DNA，方法步骤严格按照试剂盒说明书进行。用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测所提取基因组DNA的完整性、是否降解、有无蛋白质污染等，选取条带完整、清晰、条带亮度高的DNA样本进行基因扩增。
1.5 细菌16S rDNA基因扩增及高通量测序
选取细菌16S rDNA的V3～V4区序列进行基因扩增及基因测序。所用引物序列为：338F，5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3;806R，5-GGACTACH-VGGGTWTCTAAT-3。扩增反应体系为：FastPfu Buffer（5×） 4 μL、dNTPs （2.5 mM） 2 μL、Forward Primer与Reverse Primer各0.8 μL、DNA模板10 ng、FastPfu Polymerase 0.4 μL、BSA 0.2 μL、最后加入ddH2O将体系补充到20 μL。扩增反应条件为：95℃，3 min;（95℃，30 s;55℃，30 s;72℃，45 s）×30次循环;72℃，10 min。每个样本3个重复，将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，Tris_HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluorTM-ST定量系统进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。构建Illumina平台文库，进行Illumina测序。
1.6 生物信息学数据处理
对原始测序数据通过barcode分配reads，获取有效序列。运用Mothur软件对序列进行质量控制、过滤、去除嵌合体，得到优化序列。通过USEARCH软件对序列进行OTU（Operational Taxonomic Units，分类单元）聚类，将序列相似度≥97%的序列归为同一OTU。分别在界（Kingdom）、门（Phylum）、纲（Class）、目（Order）、科（Family）、属（Genus）、种（Species）水平对菌群结构进行统计分析。
1.7 统计学分析
计量资料采用“均数±标准差”表示，对Alpha多样性中的Chao指数、Ace指数、Shannon指数及Simpson指数进行统计及组间比较。采用t检验进行组间比较，P<0.05为差异有统计学意义。运用发现高维生物标识和揭示基因组特征的软件LefSe进行LDA（Linear Discriminant Analysis，线性判别式分析）分析，筛选出对样本划分产生显著性差异影响的群落。
2 结果
2.1 样本中肠道菌群Alpha多样性分析
Alpha多样性可以体现组内微生物群落的丰富度和多样性。计算菌群丰富度的指数为Chao、Ace，计算菌群多样性的指数为Shannon、Simpson。Chao、Ace指数越大说明菌群丰富度越高，Shannon、1/Simpson越大說明菌群多样性越高。Alpha指数统计结果见表1，Chao指数、Ace指数、Shannon指数、Simpson指数在两组样本间无显著统计学差异（P>0.05）。
2.2 样本中肠道菌群OTU聚类分析
对样本中所检测到的菌群基于分类学信息，对界（Kingdom）、门（Phylum）、纲（Class）、目（Order）、科（Family）、属（Genus）、种（Species）、OTU分类水平的菌群数目进行了统计，见表2。在界、门分类水平上PD组及健康对照组物种数目相等，在纲、目、科、属、种、OTU分类水平上PD组所包含的物种数目依次高于健康对照组，两组间物种数目变化在属、种、OTU分类水平上有统计学差异（P<0.05）。
2.3 样本中肠道菌群群落结构组成分析
在OTU分类学基础上，我们观察了样本中肠道菌群的群落组成情况。封三图2展示了所有受试样本中检测到的菌群在门分类水平下的群落结构。可以看出，菌群结构由4个主要的菌门组成（将检测到的丰度低于1%的菌群合并为其他）：厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria），在部分样本中也检测到了疣微菌门（Verrucomicrobia）。
