娄海芳 张乔冶 许欢 吴飞
[摘要] 目的 探讨10%KOH涂片镜检和Real-time PCR诊断念珠菌病感染的准确性研究，找到一种简单、快速、有效的临床用来诊断口腔念珠菌病的方法。 方法 于2014年1月～2017年1月期间在我院口腔科患者中选取患有口腔念珠菌病的患者100例，收集患者唾液（或含漱液）标本和口腔黏膜脱落细胞，10%KOH涂片镜检和Real-time PCR法用于检测标本中白色念珠菌，比较两种检测方法的诊断效能（灵敏度、特异度、ROC面积及预测值等）。结果 与10%KOH涂片镜检结果相比，Real-time PCR法检测念球菌的准确性更高（P<0.05）。与10%KOH涂片镜检的结果相比，Real-time PCR法检测念球菌的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值更高（P<0.05）。与10%KOH涂片镜检结果相比，Real-time PCR法检测念球菌的ROC面积值更高（P<0.05）。 结论 10%KOH涂片镜检和Real-time PCR诊断念珠菌病感染的准确性较高，Real-time PCR诊断效果更好，具有很高的临床应用价值，可快速检测和诊断口腔念珠菌病。
[关键词] 10%KOH涂片镜检;Real-time PCR;念珠菌病;诊断效能
[中图分类号] R644 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2019）22-0035-04
[Abstract] Objective To investigate the accuracy of 10%KOH smear microscopy and Real-time PCR in the diagnosis of candidiasis infection， and to find a simple， rapid and effective method for the diagnosis of oral candidiasis. Methods 100 patients with oral candidiasis were selected from the dental patients in our hospital from January 2014 to January 2017. The saliva（or gargle） specimens and oral mucosal exfoliated cells were collected for the purpose of detecting candida albicans of specimens. 10% KOH smear microscopy and Real-time PCR were applied to diagnose efficiencies（sensitivity， specificity， ROC area， Yoden index， and predicted values） of the two assays were calculated. Results The accuracy of detection of candida albicans by Real-time PCR was higher than that of the 10%KOH smear microscopy（P<0.05）. Compared with the results of smear microscopy with 10%KOH， the sensitivity， specificity， positive predictive value， and negative predictive value of candida albicans by Real-time PCR were higher（P<0.05）. Compared with the results of smear microscopy with 10%KOH， the ROC area of candida albicans by Real-time PCR assay was higher（P<0.05）. Conclusion The accuracy of 10%KOH smear microscopy and Real-time PCR for the diagnosis of candidiasis is high. Real-time PCR has a better diagnostic effect and has high clinical value. It can rapidly detect and diagnose oral candidiasis.
[Key words] 10%KOH smear microscopy; Real-time PCR; Candidiasis; Diagnostic efficacy
最近的研究发现，条件致病性真菌感染越来越得到医学界的关注，尤其是深部真菌病，其发病率和死亡率日益升高，威胁着患者的健康和生命。白色念珠菌（candidiasis） 是一種真菌，经常出现在人体内部，包括口腔、上呼吸道、肠道和阴道内，其数量在健康的体内不多，所以不会引发疾病，但是如果免疫功能下降或者正常菌群功能失调时，机体就会被真菌所感染，同时真菌还会在体液中释放代谢物，其会被作为抗原导致免疫反应，进而产生特异性抗体，特异性抗体快速繁殖，生长形式也改变为芽生菌丝相，在入侵细胞后会造成疾病。念珠菌不耐热，在60℃环境下1 h就会死亡。白色念珠菌常寄居于正常体内，当机体免疫机能持续降低或体内的微生态环境已经失调，极易引起机体患有念珠菌病。念珠菌在不同位置时可引发不同的疾病[1，2]。
念珠菌的数量与机体内的平衡共生状态被破坏时，念珠菌会变为菌丝相，而不是原来的圆形或卵圆形，从而导致其在局部快速大量的繁殖，由于近年来大量的免疫抑制剂及抗生素的滥用导致体内正常的菌群出现失调，因此白色念珠菌在临床检查中呈现感染率和发病率上升的趋势[3，4]。由于念珠菌的感染初期，患者的症状不明显，临床表现亦缺乏明显的特征性，导致念珠菌的临床早期诊断率很低，可明显影响患者的预后。
口腔念珠菌病是临床上一种常见的多发性口腔疾病，常规的临床诊断主要依靠患者的症状和体征，辅以血培养和组织病理检查检出假菌丝和大量芽孢，提示念珠菌经实验室的细菌检查证实感染[5，6]。常规检查方法虽然具有操作简单、成本较低等优点，但是该方法耗时较长、敏感性较低，容易造成假阴性而出现临床漏诊，会导致患者因病情延误而最终治疗失败[7，8]。随着分子生物学的发展，Real-time PCR法敏感性高、特异性强、重复性好、快捷方便，已逐步开始用于真菌病的诊断和研究[9]。本研究拟采用10%KOH涂片镜检和Real-time PCR法来实现临床诊断口腔念珠菌病的感染情况的研究。现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2014年1月～2017年1月于我院口腔科确诊为口腔念珠菌病患者100例作为观察组，诊断金标准：①均为口腔念珠菌感染;②真菌培养的实验室检查结果为阳性念珠菌感染;③2名专家一起给予临床确诊。排除标准：30 d内接受过抗真菌治疗或口腔局部治疗者;妊娠期或哺乳期女性;不能配合试验者。观察组男44例，女56例;平均发病年龄（59.68±11.35）岁;伪膜型念珠菌病14例，红斑型念珠菌病75例，增殖型念珠菌病11例。
1.2 方法
1.2.1 标本的采集及实验室处理 ①采集口腔黏膜病损区的脱落细胞：在病损区，采用一次性压舌板反复涂刮少许黏膜脱落细胞10 次，留取2 mL唾液，12 000 r/min离心 10 min，吸取 50 μL沉淀及上清液混匀后制成口腔黏膜涂片，并收集黏膜标本采集DNA。②唾液（或含漱液）采集：剩余唾液（或含漱液）进行下一步的真菌培养鉴定，沙保氏葡萄糖琼脂培养基进行定量检测;法国科玛嘉念珠菌显色培养基进行定性检测。
1.2.2 检测方法及结果判读 ①10%KOH 涂片镜检：采用 10%KOH 溶液消化法处理载玻片，菌丝或芽生孢子出现明显的折光性判读为阳性。②Real-time PCR法：按 DNA 提取试剂盒说明书提取念珠菌 DNA，进行PCR 扩增，并设立阳性对照和阴性对照。检出DNA扩增即为阳性。评价指标包括诊断试验的真实性（灵敏度、特异度、预测值等）及受试者工作特征曲线（ROC）下面积。
1.3 统计学方法
采用SPSS22.0统计学软件处理，计量资料满足方差齐性和正态分布，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间差异采用单因素方差分析和t检验，计数资料以[n（%）]表示，组间比较采用χ2检验与Kappa 检验，P<0.05为差异有统计学意义。比较脱落细胞和唾液标本与两种检测方法组合的诊断效能。
2 结果
2.1 10%KOH镜检和Real-time PCR法检测结果
10%KOH涂片镜检的脱落细胞阳性结果为58%（58/100），10%KOH涂片镜检唾液（或含漱液）的阳性结果为34%（34/100）。Real-time PCR法检测的脱落细胞阳性结果为92%（92/100），Real-time PCR法检测的唾液（或含漱液）阳性结果为96%（96/100）。与10%KOH涂片镜检结果相比，Real-time PCR法检测念球菌的准确性更高（P<0.05）。见表1。
2.2 10%KOH镜检和Real-time PCR法檢测的真实性评价
10%KOH镜检和Real-time PCR法检测方法的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值结果见表2、3。与10%KOH涂片镜检结果相比，Real-time PCR法检测念球菌的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值更高（P<0.05）。
2.3 ROC曲线评价10%KOH镜检和Real-time PCR法
见表4。与10%KOH涂片镜检结果相比，Real-time PCR法检测念球菌的ROC面积值更高（P<0.05）。
3 讨论
在国内外的诊断中，根据临床症状及体征结合实验室检查诊断口腔念珠菌病虽已经得到广泛认同，但仍缺乏统一的国际金标准[10，11]。菌丝（假菌丝、真菌丝）或芽生孢子确诊时，利用涂片镜检或唾液培养等方法的耗时较长，且敏感性较低，所以致力于寻求一种及时、高效的实验室检测方法有利于念球菌的临床确诊和治疗措施的实施[12，13]。本研究结果显示，10%KOH涂片镜检脱落细胞的阳性结果为58%（58/100），唾液（或含漱液）阳性结果为34%（34/100）。脱落细胞Real-time PCR法检测的阳性结果为92%（92/100），唾液（或含漱液）Real-time PCR法检测的阳性结果为96%（96/100）。与10%KOH涂片镜检结果相比，Real-time PCR法检测念球菌的准确性更高。主要由于脱落细胞10% KOH 涂片镜检观察对象与背景反差小，尤其是唾液（或含漱液）标本在离心处理后，会导致载玻片内的细胞增多，增大了观察假菌丝和芽生孢子的难度，10% KOH涂片镜检灵敏度最高，但实验室检查的特异度较低，极易受到唾液（含漱液）沉淀标本等因素干扰[14，15]。
随着分子生物学的发展，PCR法可以检测出微量的真菌DNA，己成为真菌检测的一个研究热点。Real-time PCR法，即实时检测PCR扩增产物并进行解析的方法，其敏感性高、特异性强、重复性好、快捷方便，同时还能够克服普通PCR不能准确定量、容易污染等的不足。由于其操作简单、快速方便、灵敏度高、污染率低等特点，近年来已经逐步开始应用于真菌病的诊断和研究[16，17]。本研究用DNA 提取试剂盒提取白色念珠菌标准菌株及两株临床分离菌株的 DNA，并进行PCR 扩增，通过与标准的分子量进行试验观察比较，将白色念珠菌DNA 扩增出 500 bp 左右的特异性条带，检测出 1×100个/mL的白色念珠菌。本研究结果表明，与10%KOH涂片镜检结果相比，Real-time PCR法检测念球菌的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值更高;与10%KOH涂片镜检结果相比，Real-time PCR法检测念球菌的ROC面积值更高（P<0.05），从 DNA提取到 PCR 扩增的全部过程中，提取白色念珠菌只需 6 h，缩短实验室进行血培养和组织病理检查的时间，有效提高了临床的诊断时效，说明Real-time PCR法检测念球菌诊断试验的临床应用价值最高，为疾病的治疗争取时间[18]。此种方法在检测样本中白色念珠菌的敏感度高、特异性强、可行性好、结果稳定，具有快速、方便、重复性好的优点，可以为白色念珠菌感染的早期诊断提供实验依据[19，20]。Real-time PCR检测法只能鉴定 6 种常见念珠菌以及检测白色念珠菌耐药基因突变。
本研究在严谨观察和实验室诊断的基础上，由两名专家共同确认白色念珠菌的诊断，以确定其感染和非感染的情况。在最大程度上控制了临床诊断白色念珠菌的漏诊和误诊，可更好评价临床诊断试验的可靠性。同时采用双盲法，判读人员对标本和研究对象的临床表现、分组等相关信息完全不知晓，最大程度上避免了人为偏差，确保试验结果的客观性。本研究结果提示，10%KOH涂片镜检和Real-time PCR诊断念珠菌病感染的准确性较高，Real-time PCR诊断效果更好，临床应用价值高，可作为口腔念珠菌病诊断的治疗和干预的快速检测法，其临床应用前景十分良好。但是本研究无法鉴定出来具体的菌种，并且对于免疫力低下、抗真菌治疗效果不佳的患者尚需进一步的组织病理学检查。
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（收稿日期：2019-01-14）
