扶志敏 邝世晏 李炽光 刘俊永 朱云 陈尚志
[摘要] 目的 明確非小细胞肺癌患者外周血细胞因子IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ变化及与生存率的相互关系。方法 招募2016～2017年53例非小细胞肺癌住院患者和53例健康对照者作为研究对象。收集非小细胞肺癌组入院第7天、30 d、90 d、180 d血清，ELSIA法检测并比较肺癌组和健康组血清中IL-2，IL-6，TNF-α和IFN-γ不同时间段表达差异。通过分析不同时间段非小细胞肺癌组血清中细胞因子与体重相互关系及COX回归生存分析明确影响非小细胞肺癌生存率的细胞因子。 结果 与健康对照组比较，非小细胞肺癌组血清中细胞因子IL-6和IFN-γ在第7天、30 d、90 d、180 d均出现明显升高（P<0.001，P<0.001，P<0.001，P<0.001和P=0.161，P<0.001，P=0.001，P=0.041）;而IL-2，TNF-α水平随住院时间则无明显变化。进一步分析发现非小细胞肺癌第90天和180天血清中IL-6与体重呈负相关（R=-0.368，P=0.045和R=-0.497，P=0.011）。COX回归生存分析发现非小细胞肺癌组IL-6水平与患者生存率存在负相关（P=0.023）。 结论 非小细胞肺癌会引起血清中IL-6持续升高，持续升高的IL-6可与非小细胞肺癌患者的生存率减少密切相关，血清中IL-6可作为非小细胞肺癌发生发展的生物标记物之一。
[关键词] 非小细胞肺癌;血清;IL-6;生存率
[中图分类号] R730.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2019）11-0032-05
Correlation between changes of serum IL-2， IL-6， TNF-α and IFN-γ in serum of non-small cell lung cancer and survival rate
FU Zhimin1 KUANG Shiyan1 LI Chiguang2 LIU Junyong2 ZHU Yun1 CHEN Shangzhi3
1.Department of Cardiothoracic Surgery， Chenzhou First People's Hospital in Hu'nan Province， Chenzhou 423000， China; 2.Department of Respiratory Medicine， Chenzhou First People's Hospital in Hu'nan Province， Chenzhou 423000， China; 3.Office， Chenzhou First People's Hospital in Hu'nan Province， Chenzhou 423000， China
[Abstract] Objective To determine the changes of peripheral blood cytokines IL-2， IL-6， TNF-α and IFN-γ in patients with non-small cell lung cancer and their relationship with survival rate. Methods A total of 53 non-small cell lung cancer hospitalized patients and 53 healthy controls were enrolled from 2016 to 2017. The sera of the non-small cell lung cancer group were collected on the 7 th， 30 th， 90 th， and 180 th day of the hospital. ELSIA method was used to detect and compare the expression differences in serum IL-2， IL-6， TNF-α and IFN-γ in the lung cancer group and the healthy group over time. The cytokines affecting the survival rate of non-small cell lung cancer were identified by analyzing the relationship between cytokine and body weight in serum and COX regression survival analysis in non-small cell lung cancer group at different time points. Results Compared with those of the healthy control group， the serum cytokines IL-6 and IFN-γ in the non-small cell lung cancer group were significantly increased on the 7 th， 30 th， 90 th， and 180 th days （P<0.001， P<0.001， P<0.001， P<0.001 and P=0.116， P<0.001， P=0.001， P=0.041）; while IL-2， TNF-α levels in the non-small cell lung cancer group did not change significantly with hospital stay. Further analysis found that serum IL-6 was negatively correlated with body weight on 90th days and 180th days of non-small cell lung cancer （R=-0.368， P=0.045 and R=-0.497， P=0.011）. COX regression survival analysis found that IL-6 levels in non-small cell lung cancer group were negatively correlated with patient survival（P=0.023）. Conclusion Non-small cell lung cancer can cause continuous increase of serum IL-6. The continuous increase of IL-6 is closely related to the decrease of survival rate in patients with non-small cell lung cancer. IL-6 in serum can be used as one of the biomarkers for the development of non-small cell lung cancer.
[Key words] Non-small cell lung cancer; Serum; IL-6; Survival rate
肺癌主要病理类型分为小细胞癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌占总肺癌发病率的85%，是最主要的肺癌类型。非小细胞肺癌的主要组织学亚型是腺癌和鳞状细胞癌。非小细胞肺癌预后较差，虽然小型局限性肿瘤（Ⅰ期）5年生存率为70%～90%，但是如果进展到远处转移（Ⅳ期）1年生存率仅为15%～19%[1]，因此现阶段非小细胞肺癌的早期发现和及时治疗是提高患者生存率的重要手段。敏感度和特异度高的生物标记物对非小细胞肺癌早期诊断具有重要意义，有研究提示外周血细胞因子的变化与肿瘤的侵襲及转移存在密切联系[2]。本研究通过分析非小细胞肺癌患者外周血细胞因子的变化与患者生存率之间的相互关系，探寻相关的生物标志物，为肺癌的早期治疗提供参考。
1 资料与方法
1.1 一般资料
2016年10月～2017年10月于我院招募53例非小细胞肺癌患者（排除其他肿瘤及高血压、冠心病、糖尿病等慢性疾病和急慢性感染性疾病），其中男48例，女5例，年龄中位数59岁。同时选取我院53例健康体检人群作为对照组，男43例，女10例，年龄中位数52岁。两组人群在年龄和性别分布均无统计学差异（P=0.655和P=0.265）。见表1。
1.2 诊断及纳入标准
参照中国抗癌协会肿瘤临床化疗专业委员会制定的《中国原发性肺癌诊疗规范》，对所有非小细胞肺癌患者进行诊断及纳入[3]。所有肺癌患者病理及临床分期都是通过有经验的病理和临床医生确定。
1.3 方法
1.3.1 样本收集 使用非抗凝采血管收集3 mL外周血，24 h内3000 rpm离心 10 min后取血清冻存于-80℃冰箱。
1.3.2 血清中细胞因子的检测 血清中细胞因子使用酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测，Human IL-2 ELISA Kit，Human IL-6 ELISA Kit，Human TNF-α ELISA Kit，Human IFN-γ ELISA Kit购于深圳欣博盛科技股份有限公司，所有操作均严格按照说明书进行。
1.4 统计学方法
两组间比较Mann Whitney test检验，性别分布比较Fisher精确检验，两变量之间的相互关系比较使用Spearman相关分析，肺癌患者生存分析使用COX回归，P<0.05为差异有统计学意义。上述所有数据使用SPSS 19.0和Prism 6软件进行统计分析，失访和死亡人群在两组比较分析时被剔除，非小细胞肺癌组死亡人群纳入到COX生存分析中。
2 结果
2.1 两组一般临床学特征比较
分析非小细胞肺癌患者的一般临床学指标如入院时的基本情况（7 d内），与健康对照组相比，非小细胞肺癌组的外周淋巴细胞绝对数水平显著上升（P<0.001），但其他临床指标并未见有统计学差异（P>0.05）。见表1。
2.2 血清中IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ变化
与健康对照组相比，非小细胞肺癌组患者在入院后第7天、第30天、第90天及第180天其血清中的IL-6和IFN-γ水平显著升高（P<0.001，P<0.001，P<0.001，P<0.001和P=0.161，P<0.001，P=0.001，P=0.041）;IL-2、TNF-α水平与健康对照组比较无显著变化（P>0.05）。见表2。
2.3 IL-6和IFN-γ变化与体重之间的关系
肺癌患者如果病情恶化往往会导致恶病质，其中最明显的体征是体重的改变，因此我们将外周血中IL-6和IFN-γ的变化与患者体重的变化进行相关分析，发现随着非小细胞肺癌患者体重的下降往往伴随着外周血IL-6上升，在第90天和第180天时IL-6血清水平与体重之间存在显著性负相关（R=-0.368，P=0.045和R=-0.497，P=0.011）。而非小细胞肺癌患者体重与IFN-γ水平之间并未发现相关（P>0.05）。见图1。由于体重是衡量癌变预后的重要指标之一，因此上述结果提示血清中IL-6表达可能与非小细胞肺癌预后相关。
图1 肺癌患者IL-6和IFN-γ变化与体重之间的关系
A.血清中IFN-γ水平和体重在不同时间点的变化情况;B.清中IL-6水平和体重在不同时间点的变化情况;C.第90天体重与血清中IL-6的相互关系;D.第180天体重与血清中IL-6的相互关系
2.4 血清IL-6与非小细胞肺癌生存分析
因为IL-6在血清中存在明显差异并且与患者体重负相关，我们根据患者血清IL-6水平分为两组：高水平组IL-6>6.4 pg/mL和低水平组IL-6<6.4 pg/mL。COX生存分析发现血清IL-6水平高组与IL-6低水平组相比较预后较差，生存率存在显著的统计学差异（P=0.023），风险比（hazard ratio，HR）=3.732（95% CI：1.329～10.48）。见图2。提示外周血中IL-6持续高表达可能与非小细胞肺癌的生存率有关。
图2 非小细胞肺癌患者不同外周血IL-6水平组生存率分析
3 讨论
细胞因子是炎症反应的主要介质，参与肿瘤免疫清除，并与肿瘤的预后有密切的关系。在肿瘤的发展过程中细胞因子不仅可以由机体的免疫系统产生来清除和抑制肿瘤生长，也可以由肿瘤细胞自身分泌产生来支持肿瘤自身的生长及转移。大量的研究表明炎症因子与肿瘤发生发展密切相关，如TNF-α的产生与肝癌风险增加相关[4]，外周血清IL-6与卵巢细胞癌[5]、多发性骨髓瘤[6]、淋巴瘤[7]、胶质母细胞瘤[8]的恶性程度呈正相关，TGF-β参与促进上皮肿瘤分化[9]。本研究分析了非小细胞肺癌患者外周血中IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ变化与非小细胞肺癌病程之间的关系，发现血清中IL-6水平变化与非小细胞肺癌患者的生存率下降密切相关，提示IL-6可能参与了非小细胞肺癌疾病的进展。
IL-6属于白细胞介素的一种细胞因子，主要由纤维母细胞、单核/巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞分泌。但是IL-6也可由多种瘤细胞所产生，如急性粒细胞白血病细胞[10]、口腔鳞癌细胞[11]和肺癌细胞等[12]均可以自发分泌IL-6。IL-6在肿瘤的发生发展中发挥的作用不同：一方面IL-6作为一种炎症因子参与免疫反应抑制肿瘤的生长，如IL-6通过激活Stat3信号通路降低雌激素和雄激素受体（ER和AR）的表达，引起ER和AR阳性癌细胞的生长减少，从而抑制ER和AR阳性相关肿瘤的生长[13-15];另一方面IL-6参与很多肿瘤的转移及生长，如肿瘤干细胞产生的IL-6可以自分泌方式促進肿瘤细胞的存活和增殖[16]。IL-6除了能提高肿瘤干细胞的存活率外，还可以增加肿瘤细胞迁移并诱导与上皮-间质细胞转化[17-18]。动物实验发现IL-6过表达的肿瘤细胞较IL-6敲除的肿瘤细胞更能促进肿瘤细胞的转移，而IL-6之所以能促进肿瘤细胞生长及转移可能与过快的肿瘤生长造成局部缺氧环境密切相关[19-20]。有研究发现缺氧能诱导IL-6的表达和信号传递，并且骨髓等缺氧部位是转移细胞最常见的部位，化疗和放射治疗导致局部组织缺氧环境也是引起IL-6高表达而利于肿瘤细胞生长的重要原因[21]。IL-6促进肿瘤发生发展的分子学机制可能是通过Janus酪氨酸家族激酶（JAK）途径促进肿瘤细胞增殖[22]，并上调血管内皮生长因子（VEGF）的表达，促进肿瘤血管生成及肿瘤的转移[23]。因此IL-6水平与肿瘤的发生发展存在密切的关系。我们的研究发现，外周血中IL-6高水平表达的非小细胞肺癌患者的生存率更低，这结果提示IL-6可能参与到非小细胞肺癌恶性化发展的过程中。
我们另一个发现是IL-6与非小细胞肺癌患者的体重呈负相关，因为肿瘤生长需要大量维持机体的营养物质，晚期肿瘤患者病情恶化往往会导致恶病质的发生，所有体重是衡量肿瘤患者疾病是否恶性化的重要标志。有研究发现IL-6可能诱导生长激素释放增加，而生长激素水平增强会导致脂肪分解[24]，肿瘤的发生往往伴随着高代谢，而IL-6又参与了高代谢的过程，因此非小细胞肺癌患者的体重减轻可能与体内IL-6异常表达存在密切相关。
综上所述，非小细胞肺癌患者血清IL-6水平升高可能与其生存率下降密切相关。IL-6可能不仅参与非小细胞肺癌细胞的生长及转移，更可能参与到机体的基础代谢消耗中，从而导致整个机体防御能力下降影响患者的生存率。本研究的发现提示血清IL-6可能作为非小细胞肺癌发生发展早期监测的生物标志物，为防治非小细胞肺癌提供帮助。
[参考文献]
[1] Rich AL，Khakwani A，Free C M，et al.Non-small cell lung cancer in young adults：Presentation and survival in the English national lung cancer audit[J]. QJM，2015，108（11）：891-897.
[2] 宋晓时，彭世云，宋非.细胞因子和肿瘤[J].中华检验医学杂志，2001，24（5）：318-320.
[3] 支修益，石远凯，于金明.中国原发性肺癌诊疗规范（2015年版）[J].中华肿瘤杂志，2015，37（1）：433-436.
[4] Kastl L，Sauer SW，Ruppert T，et al.TNF-α mediates mitochondrial uncoupling and enhances ROS-dependent cell migration via NF-κB activation in liver cells[J]. Febs Letters，2014，588（1）：175-183.
[5] Scambia G，Testa U，Benedetti PP，et al.Prognostic significance of interleukin 6 serum levels in patients with ovarian cancer[J].British Journal of Cancer，1995，71（2）：354-356.
[6] Rosean TR，Tompkins VS，Tricot G，et al. Preclinical validation of interleukin 6 as a therapeutic target in multiple myeloma[J]. Immunologic Research，2014，59（1-3）：188-202.
[7] Zhang L，Yang J，Qian J，et al.Role of the microenvironment in mantle cell lymphoma：IL-6 is an important survival factor for the tumor cells[J]. Blood，2012，120（18）：3783.
[8] Sampath D，Castro M，Look DC，et al.Constitutive activation of an epithelial signal transducer and activator of transcription（STAT） pathway in asthma[J]. Journal of Clinical Investigation，1999，103（9）：1353-61.
[9] Akhurst RJ，Balmain A.Genetic events and the role of TGF beta in epithelial tumour progression[J]. Journal of Pathology，1999，187（1）：82-90.
[10] 田志剛，张建华，张捷，等.急性粒细胞白血病细胞自发分泌IL-6[J].现代免疫学，1993，（3）：189.
[11] 孙祖俊，罗清琼，陈福祥.TLR4介导口腔鳞癌细胞分泌IL-6、IL-8及VEGF[J].现代免疫学，2010，（5）：395-398.
[12] 李平.肺癌细胞产生IL-6的可能性[J].国外医学情报，1996，（2）：2.
[13] Culig Z，Puhr M.Interleukin-6：A multifunctional targetable cytokine in human prostate cancer[J].Molecular & Cellular Endocrinology，2012，360（1-2）：52-58.
[14] D'Anello L，Sansone P，Storci G，et al. Epigenetic control of the basal-like gene expression profile via Interleukin-6 in breast cancer cells[J]. Molecular Cancer，2010，9（1）：300.
[15] Schroeder A，Herrmann A，Cherryholmes G，et al. Loss of androgen receptor expression promotes a stem-like cell phenotype in prostate cancer through STAT3 signaling[J].Cancer Research，2014，74（4）：1227-1237.
[16] Sansone P，Storci G，Tavolari S，et al.IL-6 triggers malignant features in mammospheres from human ductal breast carcinoma and normal mammary gland[J]. Journal of Clinical Investigation，2007，117（12）：3988-4002.
[17] Tamm I，Cardinale I，Kikuchi T，et al. E-cadherin distribution in interleukin 6-induced cell-cell separation of ductal breast carcinoma cells[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1994，91（10）：4338-4342.
[18] Douglas AM，Goss GA，Sutherland RL，et al.expression and function of members of the cytokine receptor superfamily on breast cancer cells[J]. Oncogene，1997，14（6）：661-669.
[19] Bao B，Ali S，Ahmad A，et al.Hypoxia-induced aggressiveness of pancreatic cancer cells is due to increased expression of VEGF，IL-6 and miR-21，which can be attenuated by CDF treatment[J].Plos One，2012，7（12）：e50165.
[20] Bao B，Ahmad A，Kong D，et al. Hypoxia induced aggressiveness of prostate cancer cells is linked with deregulated expression of VEGF，IL-6 and miRNAs that are attenuated by CDF[J]. Plos One，2012，7（8）：e43726.
[21] Sica A，Larghi P，Mancino A，et al.Seminars in cancer biology[J]. Seminars in Cancer Biology，2008，18（5）：349-355.
[22] Kim SY，Kang JW，Song X，et al. Role of the IL-6-JAK1-STAT3-Oct-4 pathway in the conversion of non-stem cancer cells into cancer stem-like cells[J]. Cellular Signalling，2013，25（4）：961-969.
[23] Feurino LW，Zhang Y，Bharadwaj U，et al.IL-6 stimulates Th2 type cytokine secretion and upregulates VEGF and NRP-1 expression in pancreatic cancer cells[J]. Cancer Biology & Therapy，2007，6（7）：1096.
[24] Lópezsiguero JP，Lópezcanti LF，Espino R，et al.Effect of recombinant growth hormone on leptin， adiponectin，resistin，interleukin-6， tumor necrosis factor-α and ghrelin levels in growth hormone-deficient children[J]. Journal of Endocrinological Investigation，2011，34（4）：300-306.
（收稿日期：2018-08-09）
