王广宇 陈潇潇 侯显良
[關键词] 原发性胆汁性胆管炎;16S rDNA;肠道菌群;高通量测序
[中图分类号] R575.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2021）19-0139-05
Detecting changes of intestinal microflora in patients with primary biliary cholangitis based on 16S rDNA sequencing
WANG Guangyu1 CHEN Xiaoxiao2 HOU Xianliang1
1.Central Laboratory， Guangxi Health Commission Key Laboratory of Glucose and lipid metabolism Disorders， the Second Affiliated Hospital of Guilin Medical University， Guilin 541199， China; 2.State Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases， the First Affiliated Hospital， College of Medicine，Zhejiang University， Hangzou 310006， China
[Abstract] Objective To study the abundance and diversity of intestinal flora in Primary biliary cholangitis （PBC） patients. Methods Nine patients with primary biliary cholangitis addmitted in the First Affiliated Hospital of Zhejiang University Medical College from January 2018 to January 2019 were selected as research subjects. Another 8 healthy subjects were selected as healthy controls. The intestinal flora DNA was extracted， and the corresponding gene fragments of V3-V4 region were amplified by high-throughput 16S rDNA sequencing， and the database was constructed for sequencing and bioinformatics analysis. Results In Alpha diversity analysis， there were no significant differences in ACE index， Chao index， Simpson index and Shannon index between the two groups（P>0.05）. Through OTU clustering and species annotation， we found that there were statistical differences in the abundance of some flora between the two groups （P<0.05）. Compared with healthy control group（NC）， Cellulosilyticum， Holdemanella， Lachnospiraceae， Lactococcus and Morganella were decreased and Hungatella was significantly increased in PBC group. In addition， real-time quantitative PCR was used to detect the content of intestinal Escherichia coli in the PBC group and the NC group， and it was found that the content in the PBC group was significantly higher than that in the NC group （P<0.05）. Conclusion Compared with healthy control group（NC）， the primary biliary cholangitis（PBC）group shows changes in intestinal flora to a certain extent. Further analysis of changes in intestinal flora is expected to provide new ideas for the study of the occurrence and development of primary biliary cholangitis and the search for new sensitive microbial markers.
[Key words] Primary biliary cholangitis; 16S rDNA; Intestinal flora; High-throughput sequencing
原发性胆汁性胆管炎（Primary biliary cholangitis，PBC）是一种具有器官特征性的慢性免疫疾病。典型的组织学改变为门脉区非化脓性炎症和肝内小叶间胆管的破坏，绝大多数患者的血清抗线粒体抗体阳性。主要表现为疲劳和瘙痒，晚期可能出现肝硬化相关表现，胆汁淤积也可能出现高脂血症、脂溶性维生素缺乏和骨质疏松症[1]。大约90%患者为30～60岁女性，1/3～1/2的患者常在常规检查中被发现。目前原发性胆汁性胆管炎的发病机制尚未完全阐明，部分患者的临床治疗效果无法令人满意[2]。故探讨影响原发性胆汁性胆管炎疾病发生发展的新的临床相关性因素就尤为重要。肠道微生物参与人类的免疫及代谢过程，与人类的健康状况等息息相关[3]。本研究基于16S rDNA第三代高通量测序对原发性胆汁性胆管炎组的肠道微生态进行分析，为探讨原发性胆汁性胆管炎的病因，诊断和治疗提供新的依据，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
样本采集于2018年1月至2019年1月期间（标本均为初治病例），浙江大学医学院附属第一医院收治的初治PBC患者9例，其中男2例，女7例，年龄41～65岁，平均（53.14±2.84）岁;8名健康对照者，其中男2名，女6名，年龄43～63岁，平均（53.21±2.35）岁。以《原发性胆汁性肝硬化（又名原发性胆汁性胆管炎）诊治共识（2015）》为诊断依据，如果满足以下三个标准中的两个即可诊断为原发性胆汁性胆管炎：①血清中抗线粒体抗体或抗线粒体抗体-M2型抗体呈阳性;②反映胆汁淤积的生化指标（血清碱性磷酸酶、谷氨酰转移酶）升高;③肝脏组织病理学特征符合原发性胆汁性胆管炎。本研究经过伦理审查委员会批准，伦理号为2015-313，并获得每位患者和志愿者的书面知情同意书。受试者在医院的粪便收集器中收集2～3 g新鲜粪便样品，并迅速将其保存在-80℃冰箱中。
1.2 主要仪器及试剂
Eppendorf 5415R微型离心机（Eppendorf，德国），-80℃冰箱 （Thermo Fisher，美国），电子天平（Sartodus，德國），Miseq 测序仪（Illumina，美国），AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒（Axygen，美国），DL2000 DNAMarker（Takara，日本），NanoDrop超微量核酸定量仪（Thermo，美国），MiSeqReagentKitsv3 测序相关试剂（Illumina，美国），TransStart Fastpfu DNA Polymerase PCR试剂（全式金生物，中国），QIAamp FastDNA Stool Mini Kit 肠道菌群DNA 提取试剂盒（QIA-GEN，德国）。
1.3 DNA提取与测序
按照DNA提取试剂盒 QIAamp Fast DNAStool Mini Kit提取细菌菌群总DNA，使用DNA纯化试剂盒纯化。将纯化后的DNA利用凝胶成像系统拍照，然后用超微核酸定量仪检测DNA样品浓度和相应的OD260/OD280。根据微生物的16S rDNA基因的V3～V4 区（336F-806R）的保守区设计引物，在引物末端添加测序接头，进行PCR扩增，并对其产物纯化、定量并均质化以形成测序文库。首先进行库质量检查，然后使用Illumina HiSeq 2500对合格库进行测序。将通过高通量测序获得的原始图像数据文件通过碱基检出分析转换为原始测序的读段，并将结果存储为FASTQ文件格式，包含顺序读取、序列信息及相应的测序质量信息。
1.4 数据处理
根据PE读段之间的重叠关系，将通过Hiseq测序获得的配对末端序列数据合并为标签序列，并对读段的质量和拼接效果进行质量控制和过滤。主要有如下3个步骤：①PE读取拼接：使用 FLASH v1.2.7软件通过重叠拼接每个样本的读数，得到的拼接序列为原始数据数据（Raw data）。②标签过滤：使用Trimmomatic v0.33软件对拼接的原始标签过滤，以获取高质量的干净数据（Clean data）。③删除嵌合体：使用UCHIME v4.2软件识别并删除嵌合体序列，获得最终的有效数据（Effective data）。使用RDP分类器对每个序列进行分类和注释，比较Silva数据库（SSU123），并将比较阈值设置为70%。然后分析OTU的丰度和多样性指数。同时，在每个分类水平进行注释分析，以此研究发现PBC患者与健康者之间的群落构成和多样性差异。
1.5 PCR检测大肠杆菌的含量
基于以上9例初治病例的基础上，另采样并检测28例原发性胆汁性胆管炎患者的大肠杆菌含量，包括男性6例和女性22例，年龄40～65岁，中位年龄55岁。同时另外采集健康体检标本23份，其中男3份，女20份，年龄42～63岁，中位年龄53岁。无肿瘤、自身免疫病、肝病和相应家族史的病史。设计并合成针对16S rDNA基因V3～V4区的特异性PCR引物，以评估16S rDNA基因的总量（即总细菌量）。此外，设计并合成大肠杆菌PCR特异引物（表1），以评估大肠杆菌的量。将已知拷贝数的大肠杆菌基因组先稀释为1010 copy/μL，再按10倍稀释，以浓度为102～108 copy/μL的大肠杆菌基因组作为标准样品，制作定量标准曲线。扩增反应体系为：SYBRR Premix DimerEraser（2×）10 μL、ROX Reference Dye（50×）0.4 μL、Forward Primer与 Reverse Primer各0.6 μL、DNA 模板2 μL、最后加入ddH2O 将体系补充到20 μL。扩增反应条件为：95℃，30 s;（95℃，15 s;60℃，34 s;72℃，15 s）×40次循环;72℃，10 min。
1.6 统计学方法
统计比较各组中Alpha多样性分析中的Ace指数、Chao指数、Simpson指数、Shannon指数。采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 原发性胆汁性胆管炎组（PBC）和健康对照组（NC）样本测序结果
通过对PBC组和NC组的肠道微生物16S rDNA基因的V3～V4区进行测序，将测得的原始数据进行过滤并统计分析，结果表明17个样品原始数据序列条数为1331 895，通过对原始测序序列进行过滤、双端拼接，得到优化序列1010 828条，平均每个样品产生序列条数为78 347。为了进一步研究样品中微生物群落的种类组成和多样性，将所有样品的所有过滤后的有效标签聚类到操作分类单元（Operational taxonomic unit，OTU）中并以97%的相似度对种类进行分类。之后经过数据库比对和筛选，不同样本的序列和OTU见表2、图1～2。原发性胆汁性胆管炎患者和健康者样本共17个样本经过过滤后得到的拼接序列总数和OTU总数的平均值分别为59 440和219。
2.2 肠道菌群的Alpha多样性分析
Alpha指数可较好的反映该菌群的丰度和多样性。丰度的相对应指标是Ace指数和Chao指数，而多样性相对应的指标是Simpson指数和Shannon指数。Ace和Chao指数越大，丰度越高，Shannon指数和Simpson指数的比值越大，菌群就越丰富。见表3。两组样本之间的Chao指数，Ace指数，Shannon指数和Simpson指数比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
2.3 样本中肠道菌群群落结构组成分析
在97%的相似度水平上，从封三图4可以看出，PBC组和NC组各自包含的 OTU 数目分别为467和460，两组所共有的OTU数目为429，PBC组和NC组所特有的OTU数目分别为38和31，说明两组之间共有较多的核心微生物和相似的物种组成。
此外，花瓣图展示各样本间OTU数的分布情况（封三图5）。花瓣图中央区域的数字表示所有样本共有的OTU个数，花瓣上的数字表示各个样本特有的OTU个数。从图中可得出，各样本之间或多或少都含有共同的OTU物种，各样本之间共有的OTU个数为6。
2.4 物种之间的丰度分析
根据OTU物种分类结果，统计分析两组样品的菌种及相对丰度。基于菌落的分类学信息，统计了菌落在界（Kingdom）、门（Phylum）、纲（Class）、目（Order）、科（Family）、属（Genus）、种（Species）等层面的PBC组和NC组的菌群组成。封三图6和封三图7分别是科水平上两组间的各菌落丰度分析、属水平上各样本间的菌落丰度分析。发现两组间某些菌群的丰度比较，差异有统计学意义（P<0.05）。在科水平上，PBC组没有发现梭菌（Clostridiales），而在NC组存在该菌群（图3）。在属水平上与NC组相比，PBC组缺失了解纤维素根瘤菌（Cellulosilyticum）、霍尔德曼氏菌（Holde-manella）、毛螺菌（Lachnospiraceae）、乳酸乳球菌（Lactococcus）和摩根菌（Morganella），而亨盖特拉菌（Hungatella）在PBC组中显著升高（图4）。
2.5定量PCR检测大肠杆菌
采用实时定量PCR检测PBC组和NC组肠道中大肠杆菌的丰度，发现PBC组肠道细菌中大肠杆菌的百分比显著高于NC组（P=0.021）（表4）。从肠道微生态的角度揭示了大肠杆菌与原发性胆汁性胆管炎具有某种相关性，大肠杆菌这一菌群可能对原发性胆汁性胆管炎的发生发展起着重要作用。
3 討论
肠道微生态在人类微生态系统中的地位不言而喻。肠道微生态由肠道菌群和菌落所生活的环境构成。肠道微生物在整个人体总微生物量中占比超过一半，种类约为400～500种。肠道菌群的稳定与机体的健康密切相关，平衡一旦被打破就会引发多种疾病。另外，肠道微生物在吸收水分、缓和肠道蠕动、维他命的合成等生理过程中起着重要作用。因此，保持肠道微生物平衡对抵御由肠道病原菌引起的疾病至关重要[4]。
肠道微生态系统主要由肠道黏膜和肠道菌群组成，在功能和解剖上与肝脏密切相关，通过“肠-肝轴”参与维持多种生理、免疫和代谢功能[5]。目前，“肠肝轴”的概念已被广泛接受，并被认为与各种肝病的发生和进展有关，如酒精性和非酒精性脂肪肝、胆汁淤积性肝病、肝癌、慢性肝损伤引起的急性肝衰竭、肝纤维化/硬化进展和肝硬化并发症[6-7]。文献表明，肠道菌群和肝脏在维持免疫稳态方面的关系是复杂的。一方面，肠道微生物可以影响包括肝脏在内的免疫系统的发育和功能，而宿主免疫系统可以调节肠道微生物群落的组成和多样性[8]。另一方面，肠道菌群失调会诱发免疫性肝损伤，肝功能受损时，胆汁分泌异常，肝脏解毒能力下降，可引起肠道菌群异常，肠道细菌过度生长，肠黏膜屏障功能受损[9]。
本研究分析了原发性胆汁性胆管炎组和健康对照组的肠道菌群。结果显示两组间肠道菌群的Alpha多样性指数无显著差异。在相似度为97%的情况下，得到每个样本的OTU数，韦恩图和花瓣图显示两组间共有的核心微生物较多，物种组成较相似。以OTU 的物种分类结果为依据，在科水平上两组样本中梭菌（Clostridiales）的丰度有显著差异。而在属水平上解纤维素根瘤菌（Cellulosilyticum）、霍尔德曼氏菌（Holdemanella）、毛螺菌（Lachnospiraceae）、乳酸乳球菌（Lactococcus）、摩根菌（Morganella）和亨盖特拉菌（Hungatella）的丰度有显著差异。
现如今，自然界中大多数微生物菌落不能通过传统方法培养得到，且细菌培养实验周期长、污染率较高等劣势使得该技术具有很大的局限性。随着生物技术和生物信息学的发展，16S rDNA基因测序技术在微生物鉴定中的应用越来越普遍[10]。可以预见，通过高通量测序技术可以检测出原发性胆汁性胆管炎患者肠道菌群的分布、基因及代谢产物变化等。
肠道菌落这一庞大家族，近年来已逐渐成为疾病研究的热点，但目前对其认识还仅停留在一定的层面，道路依然漫长。将对疾病敏感的肠道微生物作为新型疾病生物标志物[11-12]有着特殊的意义，未来必将成为对疾病的预测干预和治疗的有效手段[13-14]。这些还需要经过长时间的研究和进一步的明确。通过研究已经可以确定肠道菌群和人类的生理活动状态之间有着某种临床相关性[15]。随着高通量技术的发展，患者肠道菌群的变化有望为原发性胆汁性胆管炎的治疗预后提供新的选择。
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（收稿日期：2021-02-02）
