王亚萍 余军辉 王凯
[关键词] 卵巢癌;肌动蛋白相关蛋白复合体2;迁移;Wnt/β-catenin通路
[中图分类号] R737.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2021）19-0038-06
Down-regulation of ARPC2 reducing the malignant metastatic potential of ovarian cancer OVCA429 cells by inhibiting Wnt/β-catenin pathway
WANG Yaping YU Junhui WANG Kai
Department of Gynecology， Taizhou Hospital of Zhejiang Province affiliated to Wenzhou Medical University， Taizhou 318050， China
[Abstract] Objective To investigate the effect and mechanism of down-regulation of actin-related protein complex 2 （ARPC2） on the malignant metastatic potential of ovarian cancer OVCA429 cells. Methods The changes of APC2 expression in ovarian cancer Skov3，A2780，OVCA429 cells，and normal ovarian IOSE386 cells were detected by qRT-PCR and Western blot.Arpc2 siRNA was transfected into ovarian cancer OVCA429 cells.Cell proliferation was determined by MTT.Cell migration and invasion were detected by the Transwell chamber. The ARPC2，β-catenin，c-myc，MMP-9，MMP-2 protein expression in cells were detected by Western blot.The ovarian cancer OVCA429 cells transfected with APC2 siRNA were treated with the Wnt/β-catenin activator LiCl.Cell proliferation，migration，and invasion changes were also measured by the above method. Results The expression level of ARPC2 in ovarian cancer Skov3，A2780，and OVCA429 cells was significantly higher than that of normal ovarian IOSE386 cells.The expression level of ARPC2 was the highest in ovarian cancer OVCA429 cells. After the transfection of APC2 siRNA，the proliferation ability of ovarian cancer OVCA429 cells decreased，and the cell migration and invasion ability also decreased.The expression of APC2，β-catenin，c-myc，MMP-9，MMP-2 protein in the cells decreased. The Wnt/β-catenin activator LiCl can reverse the inhibitory effects of APC2 siRNA on the proliferation，migration，and invasion of ovarian cancer OVCA429 cells. Conclusion Down-regulation of APC2 reduces the malignant metastatic potential of ovarian cancer OVCA429 cells by inhibiting the activation of Wnt/β-catenin pathway.
[Key words] Ovarian cancer;Actin-related protein complex 2;Migration;Wnt/β-catenin pathway
卵巢癌是臨床上常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度高、转移能力强，很多卵巢癌患者在确诊时已经发生了远处转移，给卵巢癌的治疗带来了巨大挑战[1]。研究显示，卵巢癌的发生是一个基因异常表达的过程，卵巢癌组织有着与正常组织不同的基因表达谱，这些基因可能是卵巢癌治疗的分子靶点[2]。肌动蛋白相关蛋白复合体2（Actin-related protein complex2，ARPC2）是一个具有调控细胞骨架运动和构成的肌动蛋白相关蛋白2/3（Actin-related protein 2/3，Arp2/3）复合物的亚基之一，ARPC2在人体组织中表达，参与调控细胞生长、侵袭等过程[3]。ARPC2还参与人类多种疾病发生，ARPC2在乳腺癌、胃癌等肿瘤组织中表达上调，下调ARPC2抑制肿瘤细胞侵袭和迁移，ARPC2可能是一种癌基因[4-5]。Wnt/β-catenin在人体内普遍存在，其在肿瘤进展中过度激活，β-catenin表达上调后可以诱导下游基因c-myc的激活，促进肿瘤进展[6]。Arp 2/3复合物介导的肌动蛋白聚合反应可被Wave复合物激活，从而实现细胞扩散，迁移，粘附和分裂。其中，Wave复合物在Wnt /β-catenin途径中具有调节功能[7]。
现阶段对于ARPC2对卵巢癌细胞恶性生长、迁移和侵袭的作用和机制还不明确。本部分实验首先探讨ARPC2在卵巢癌细胞和正常卵巢细胞中的表达变化，通过细胞转染的方法下调卵巢癌细胞中ARPC2表达水平，探讨下调ARPC2对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响和机制，为分子靶向治疗卵巢癌提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
MMP-9抗体购自上海信裕生物科技有限公司;正常卵巢IOSE386细胞购自上海宾穗生物科技有限公司;ARPC2抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology;卵巢癌Skov3、A2780、OVCA429细胞购自上海慧颖生物科技有限公司;引物由广州伯信生物科技有限公司合成;siRNA control、ARPC2 siRNA购自上海吉玛制药技术有限公司;β-catenin抗体购自南京建成生物工程研究所;c-myc抗体购自安捷伦科技（中国）有限公司;MMP-2抗体购自上海士锋生物科技有限公司。
1.2 qRT-PCR检测卵巢癌细胞中ARPC2 mRNA表达
收集卵巢癌Skov3、A2780、OVCA429细胞和正常卵巢IOSE386细胞，添加Trizol试剂提取总RNA。取得到的RNA样品，添加1 μL的Oligo（dT）、1 μL的random，补ddH2O至12.5 μL，放在70℃孵育5 min，然后放在冰上冷却。再加入4 μL的5×Buffer、2 μL的dNTP、0.5 μL的RNasin、1 μL的M-MLV，均匀混合以后，放在25℃孵育10 min，42℃孵育50 min，80℃孵育10 min，放在冰上冷却。得到的cDNA进行PCR检测，PCR体系配制如下：1 μL的cDNA、0.5 μL的上下游引物、10 μL的SYBR Green mastermix，添加ddH2O至20 μL，反应条件为：94℃孵育5 min，94℃孵育10 s，60℃孵育20 s，72℃孵育30 s。引物为：ARPC2 forward，5'-TCCGACTCTACCAGCTGATGC-3' 和 reverse，5'-AAGCTGGACTCATCCCACAGC-3';内参GAPDH forward，5'-GGTGGTCTCCCTCGACTTCAACAG-3' 和 reverse，5'-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3'。按照2-△△Ct法计算ARPC2 mRNA表达水平。
1.3 Western blot检测卵巢癌细胞中ARPC2蛋白表达
收集卵巢癌Skov3、A2780、OVCA429细胞和正常卵巢IOSE386细胞，在细胞中添加蛋白抽提试剂，放在冰上裂解20 min，将蛋白上清吸取并保存在-20℃。用BCA方法对提取的蛋白样品进行浓度测定。组装SDS-PAGE电泳装置，选择5%的浓缩胶以及10%的分离胶进行电泳。取蛋白样品，添加5×电泳缓冲液混合后，放在沸水浴中孵育5 min。每个孔中上样量为20 μg蛋白，以80 V的恒压电泳3 h。将PVDF膜裁剪成适当尺寸，用无水甲醇浸湿以后，再放置于转移缓冲液中浸泡10 min。以80 V电压转膜1.5 h。把PVDF膜放在脱脂奶粉溶液中，在室温摇床孵育1 h;然后将PVDF膜放在一抗工作液中，在4℃结合10 h;PVDF膜放在二抗工作液中，在室温环境中结合1 h。用ECL发光以后，以Gel-pro-Analyzer分析条带的A值。内参为GAPD h，以目的条带A值÷内参GAPDH条带A值表示目的蛋白表达水平。ARPC2一抗按照1∶800稀释，二抗以1∶2000稀释。
1.4 细胞分组处理
卵巢癌OVCA429细胞分成Control、si-NC、si-ARPC两组，其中si-NC、si-ARPC2组分别为转染siRNA control、ARPC2 siRNA的卵巢癌OVCA429细胞，Control组为没有转染的卵巢癌OVCA429细胞。细胞转染方法按照Lipofecta mine 2000转染操作说明进行。Control、si-NC、si-ARPC2组细胞培养24 h以后，用Western blot方法检测细胞中ARPC2、β-catenin、c-myc、MMP-9、MMP-2蛋白表达变化，步骤同1.3。β-catenin、c-myc、MMP-9、MMP-2抗体分别按照1∶1000、1∶800、1∶1000、1∶1000的比例稀释。
1.5 MTT法测定细胞增殖
将卵巢癌OVCA429细胞按照Control、si-NC、si-ARPC2组分组方法接种到96孔板中，每个孔中添加4000个细胞，置于37℃，5%CO2培养箱中继续培养24 h。取出培養板，在每个孔中添加10 μL的MTT溶液，放在37℃孵育4 h。倒掉上清，添加150 μL的DMSO溶液，震荡反应10 min以后，检测450 nm的A值。A值越大，细胞增殖能力也就越强。
1.6 Transwell小室测定细胞迁移及侵袭能力
将孔径为8 μm的Transwell小室放在24孔板内，小室内为上室，小室外为下室。细胞迁移步骤如下：取Control、si-NC、si-ARPC2组细胞，以不含血清的细胞培养液将细胞浓度调整到7×105个细胞/mL，吸取200 μL添加到上室中，同时在下室中添加500 μL的含有胎牛血清的细胞培养液，置于37℃，5%CO2培养箱中继续培养24 h。取出小室，用4%的多聚甲醛溶液固定以后，放在0.1%的结晶紫溶液中孵育10 min。放在显微镜下观察细胞迁移情况，选择5个视野，分析细胞迁移数目。细胞侵袭实验步骤同上，在侵袭实验前需要用基质胶将小室包被。
1.7 Wnt/β-catenin激活剂LiCl对ARPC2 siRNA影响细胞增殖、迁移和侵袭的作用检测
取转染ARPC2 siRNA后的卵巢癌OVCA429细胞，用含有Wnt/β-catenin激活剂LiCl浓度为10 mmol/L的细胞培养液培养，记为si-ARPC2+LiCl组，将si-ARPC2组作为参照，MTT检测细胞增殖，Transwell小室检测细胞迁移和侵袭，用Western blot方法检测细胞中β-catenin、c-myc、MMP-9、MMP-2蛋白表达变化，步骤同1.5、1.6、1.3。
1.8 统计学分析
采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，数据以均数±标准差（x±s）表示，两组数据间比较用t检验，多组差异比较用单因素方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 ARPC2在卵巢癌细胞中高表达
见图1和表1，卵巢癌Skov3、A2780、OVCA429细胞中ARPC2 mRNA和蛋白水平均高于正常卵巢IOSE386細胞。ARPC2在卵巢癌细胞中高表达。选择表达水平最高的卵巢癌OVCA429细胞作后续实验。
2.2 ARPC2 siRNA对卵巢癌OVCA429细胞增殖、迁移、侵袭的影响
见图2和表2，转染ARPC2 siRNA后的卵巢癌OVCA429细胞A值、迁移数目、侵袭数目以及ARPC2、MMP-9、MMP-2蛋白表达水平均降低。ARPC2 siRNA下调卵巢癌OVCA429细胞中ARPC2表达水平，抑制卵巢癌OVCA429细胞增殖、迁移和侵袭能力。
2.3 ARPC2 siRNA对卵巢癌OVCA429细胞中Wnt/β-catenin信号通路影响
见图3和表3，转染ARPC2 siRNA后的卵巢癌OVCA429细胞β-catenin、c-myc蛋白表达水平均降低。ARPC2 siRNA下调卵巢癌OVCA429细胞中Wnt/β-catenin信号通路激活水平。
2.4 激活Wnt/β-catenin逆转ARPC2 siRNA影响卵巢癌OVCA429细胞增殖、迁移和侵袭作用
见图4和表4，与未经Wnt/β-catenin激活剂LiCl处理的细胞比较，转染ARPC2 siRNA后的卵巢癌OVCA429细胞经过LiCl处理以后，细胞A值、迁移数目、侵袭数目以及细胞中β-catenin、c-myc、MMP-9、MMP-2蛋白表达水平均升高。激活Wnt/β-catenin逆转ARPC2 siRNA对卵巢癌OVCA429细胞增殖、迁移和侵袭作用。
图4 Western blot检测ARPC2 siRNA转染后经Wnt/β-catenin激活剂LiCl处理的卵巢癌OVCA429细胞中β-catenin、c-myc、MMP-9、MMP-2蛋白表达情况
3 讨论
ARPC2是一种在细胞发育过程中不可缺少的细胞骨架调控因子，是Arp的亚基之一，在肌动蛋白组装过程中发挥重要作用[8]。ARPC2最先发现于棘阿米巴中，在细胞的细胞质及细胞膜中表达，在进化上较为保守，参与了微丝核化过程，位于两条微丝分支位置的ARPC2以70度方式连接，进而引起质膜的变化，促进细胞前行，ARPC2还可以通过细胞中的牵引力场影响细胞体力[9]。肿瘤的转移与细胞骨架改变有关，ARPC2参与肿瘤进展，ARPC2在胃癌、乳腺癌等肿瘤中高表达，下调其表达可以降低肿瘤细胞的侵袭和迁移能力，ARPC2在肿瘤进展中可能发挥原癌基因的作用[4-5]。本次实验结果显示，ARPC2在卵巢癌细胞中高表达，并且下调ARPC2后的卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭能力均下降，这说明ARPC2在卵巢癌进展中也可能发挥类似癌基因的作用。
肿瘤的转移是一个十分复杂的过程，肿瘤细胞从原来的位置脱落，合成基质降解酶，将细胞外基质降解，为肿瘤的转移提供条件[10]。基质金属蛋白酶是在自然界生命体内进化十分保守的一种蛋白酶，其属于锌依赖性的内肽酶，基质金属蛋白酶几乎可以降解所有的细胞外基质成分[11-12]。目前已经发现了多种基质金属蛋白酶，其可以在生理以及病理条件下将胶原、纤维蛋白、黏连蛋白、明胶等成分降解[13]。研究显示，基质金属蛋白酶与肿瘤的转移和侵袭关系密切[14]。MMP-2和MMP-9均属于基质金属蛋白酶家族成员，在肿瘤转移中发挥促进作用[15]。肿瘤组织中MMP-2和MMP-9表达水平越高，细胞侵袭和迁移能力也就越强[16-17]。本次的实验显示，下调ARPC2后的卵巢癌细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平下降，说明下调ARPC2抑制卵巢癌细胞转移潜能，这与细胞迁移和侵袭检测结果相符合。
Wnt首次是在小鼠乳腺癌中发现的，其参与调控胚胎发育[18]。Wnt/β-catenin是經典的Wnt信号通路途径之一，其在胞质水平上影响和激活β-catenin，当β-catenin到达一定水平以后，可以激活下游基因如c-myc的转录和表达，进而引起Wnt/β-catenin信号通路的激活[19-21]。Wnt/β-catenin与胚胎干细胞生长有关，在机体新陈代谢、细胞衰老、稳态维持等方面具有重要作用[22]。Wnt/β-catenin还与肿瘤有关，在肿瘤生长、转移等过程中发挥促进作用[23]。在肺癌、卵巢癌、乳腺癌等肿瘤中已经发现，抑制Wnt/β-catenin可以降低肿瘤细胞的恶性转移能力[24-26]。Arp 2/3复合物与Wnt /β-catenin途径可被Wave复合物所调控[7]，但ARPC2与Wnt /β-catenin信号通路的关系尚不清楚。本部分实验表明，下调ARPC2后的卵巢癌细胞中β-catenin、c-myc蛋白表达水平下降，说明下调ARPC2可以下调Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白β-catenin及其下游蛋白c-myc的表达水平，抑制Wnt/β-catenin信号通路活性。此外，进一步的研究表明，Wnt/β-catenin激活剂可以逆转下调ARPC2对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，这说明下调ARPC2通过抑制卵巢癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路的激活水平发挥作用。
总而言之，ARPC2在卵巢癌进展中可能发挥类似癌基因的作用，下调ARPC2可以降低卵巢癌细胞恶性生长和转移能力，其作用机制与抑制Wnt/β-catenin信号通路激活水平有关。这为研究卵巢癌分子发生机制提供了参考，为分子靶向治疗卵巢癌提供了新方向。本实验存在一定的局限性，尚未对ARPC2通过何种靶向机制影响Wnt/β-catenin进而调控卵巢癌进展进行深入探讨，后续会对该部分内容进行研究。
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（收稿日期：2020-05-18）
