赵学正 高伟 唐保永 郑思化 李利军
[關键词] 5-羟基-4'-硝基-7-丙酰氧基金雀异黄素;增殖;迁移;侵袭;凋亡
[中图分类号] R738.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2021）16-0037-06
Effects and mechanisms of novel genistein derivatives in inhibiting the migration and invasion of osteosarcoma MG-63 cells
ZHAO Xuezheng GAO Wei TANG Baoyong ZHENG Sihua LI Lijun
Department of Orthopedics， Hangzhou Xixi Hospital， Hangzhou 310023， China
[Abstract] Objective To detect the inhibitory effect of novel genistein derivatives HNPG on the migration and invasion of osteosarcoma MG-63 cells and its possible molecular biological mechanism. Methods Osteosarcoma MG-63 cells were cultured in vitro，and MTT was used to detect the proliferation inhibitory effect of HNPG on MG-63 cells. The scratch test was used to detect the migration inhibitory effect of HNPG on MG-63 cells. The Transwell was used to detect the inhibitory effect of the invasion of HNPG on MG-63 cells. PI staining FCM was used to detect the blocking effect of HNPG on the G1 phase of MG-63 cells. AV-PI staining FCM was used to detect the apoptosis induction effect of HNPG on MG-63 cells. Western blotting was used to detect the regulatory effect of HNPG on the expression of p53，bcl-2， and bax proteins in MG-63 cells. Results HNPG inhibited the proliferation of MG-63 cells in a time and concentration-dependent manner in vitro. The IC50 of 24 h was（4.8±0.6） μmol/L. The 24 h proliferation inhibition rate of MG-63 cells treated by 5 μmol/L of HNPG was（45.2±4.6）%， which was higher than that of（0.40±0.02）% in the NS group， the difference was significant （P<0.05）. The scratch healing rate was（38.24±2.48）%， which was lower than that of （71.23±4.62）% in the NS group， the difference was significant（P<0.05）. The invasion inhibition rate was（44.66±2.06）%，which was higher than that of （0.34±0.03）% in the NS group， the difference was significant（P<0.05）. The proportion of cells in the G1 phase （78.65±3.48）%， which was higher than that of （64.40±2.02）% in the NS group，the difference was significant （P<0.05）. The apoptosis rate was increased more statistically（24.63±2.12）%， which was higher than that of （2.75±0.20）% in the NS group， the difference was significant（P<0.05）. At the same time the expression of p53 and bax protein was up-regulated， while the expression of bcl-2 protein was down-regulated，which was statistically significant compared with the NS group（P<0.05）. Conclusion HNPG can significantly inhibit the proliferation， migration， and invasion of MG-63 cells in vitro，and its mechanism may be that it blocks cells in G1 phase， up-regulates the expression of p53 protein， activates the expression of bax protein， inhibits the expression of bcl-2 protein， and induces apoptosis.
[Key words] 5-hydroxy-4'-nitro-7-propionyloxygenistein; Proliferation; Migration; Invasion; Apoptosis
化疗在骨肉瘤治疗方面有着极其重要的作用，术后化疗和新辅助化疗的临床应用极大改善了骨肉瘤患者预后，因此开发新型化疗药物便成为肿瘤工作者的靶向之一[1]。既往文献报道，金雀异黄素具有抗肿瘤等作用，然而溶解度差、生物利用度小限制了其临床应用[2]，而通过基因修饰可以提高GEN的溶解性和生物利用度，增加抗肿瘤活性，新型金雀异黄素衍生物（5-hydroxy-4'-nitro-7-propionyloxy-genistein，HNPG）是在金雀异黄素母核C-4'引进硝基、C-7引进丙酰氧基的新型衍生物，具有抗肿瘤活性[3]，然而其对骨肿瘤的生物作用尚未进行报道。本研究通过检测HNPG对骨肉瘤MG-63细胞活性的抑制作用，探讨其可能的细胞通路，为HNPG的抗肿瘤应用提供理论指导和实验数据，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 骨肉瘤MG-63细胞体外培养和实验耗材
人骨肉瘤MG-63细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心，对数生长期的MG-63细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，细胞培养箱温度为37℃，湿度为饱和湿度内含5%CO2。HNPG（分子式：C18H13O7N，分子量：355，色泽：浅黄色，性状：粉末，纯度：98%）由海军军医大学金永生教授惠赠。一抗p53（BM4206）、bcl-2（A00040-1）、bax（A00183）和GAPDH（A00227-1）购自BOSTER生物技术有限公司。MTT（C0009）、青霉素-链霉素溶液（100×）（C0022）、胰蛋白消化酶（C0205）和BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0012S）、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（C0162）购自Beyotime生物技术研究所。细胞裂解液（ARAR0107）和标准胎牛血清（PYG0001）购自BOSTER生物技术有限公司。
1.2 MTT法检测HNPG对骨肉瘤MG-63细胞增殖抑制率
取96孔细胞培养板，以密度5000个/孔接种MG-63细胞，培养24 h待其贴壁，然后每孔添加HNPG使其终浓度分别为0.625、1.25、2.5、5、10、20和40 μmol/L，待HNPG作用细胞24 h后，采用酶标仪检测HNPG对MG-63细胞的增殖抑制率，获取HNPG抑制MG-63细胞增殖的最佳浓度用于后续实验。取DDP（5 μmol/L）、GEN（160 μmol/L）、HNPG（5、10、20 μmol/L）培養24 h，弃去细胞培养基，更换新的细胞培养基，添加 MTT使其终浓度为5 mg/L，作用MG-63细胞4 h，弃去含MTT的细胞培养基，每孔添加100 μL DMSO，静置10 min，上酶标仪（型号：ELX-800 type）检测MG-63细胞结晶紫光密度，发射光波长为570 nm。细胞增殖抑制率公式：IR=（1-λ实验组/λ空白对照组）×100%，按改良寇氏法求出IC50[4]。以上实验重复3次。
1.3划痕实验检测HNPG对骨肉瘤MG-63细胞迁移的影响
取对数期生长的MG-63细胞，培养24 h后完全贴壁后，更换培养基，PBS冲洗2遍，用200 μL无菌枪头在孔内轻轻地划1～3道痕，再用PBS冲洗去掉脱落的细胞，倒置显微镜下拍照。随后添加DDP（5 μmol/L）、GEN（160 μmol/L）、HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）后继续培养24 h，弃去培养基，用PBS清洗2遍，95%酒精固定，随意选取3个不同位置，在倒置显微镜下拍照（×100），并采用Image J软件测量划痕宽度，计算平均值，以划痕愈合率代表细胞的迁移能力，划痕愈合率=（0 h划痕宽度-24 h划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%[5]。实验重复3次，取平均值进行统计分析。
1.4 Transwell法检测HNPG对骨肉瘤MG-63细胞侵袭的影响
取预冷24 h的24孔Transwell培养板，将30 μL MatrigelTM人工基质胶（无血清培养基按1：3配置），轻柔地铺在Transwell装置的上室并静置3 h。取对数期生长的MG-63细胞200 μL（2×105/mL）置于上室的胶层上，再将上室置于每孔含DDP（5 μmol/L）、GEN（160 μmol/L）、HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）10%胎牛血清+RPMI 1640培养液500 μL的下室中，于37℃、5%CO2孵育箱中培养24 h，然后用PBS液冲洗胶层，在室温下用95%甲醇固定15 min，再用结晶紫染色15 min。高倍镜（200×）下随机对5个视野的细胞进行连续计数，取均值。侵袭抑制率按如下公式计算：细胞侵袭抑制率（%）=（空白对照组穿膜细胞数-实验组穿膜细胞数）/空白对照组穿膜细胞数×100%[6]。实验重复3次，取平均值进行统计分析。
1.5 FCM法检测HNPG对骨肉瘤MG-63细胞周期的影响
取对数期生长的MG-63细胞，培养24 h完全贴壁后，更换培养基，分别添加DDP（5 μmol/L）、GEN（160 μmol/L）、HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）继续培养24 h，更换细胞培养基，用0.25%的胰酶消化，以2000 rpm离心5 min，弃去上清液，分别用50 mmol/mL的碘化吡啶（PI）溶液1 mL混悬，在暗室于37℃静置30 min，用DMEM细胞培养液混悬3次，采用流式细胞仪进行检测，实验用激发波为488 nm，而实验用发射波为530 nm[7]。细胞周期检测重复3次，取细胞周期的平均值进行统计分析。
1.6 FCM法检测HNPG对骨肉瘤MG-63细胞凋亡的影响
取对数期生长的MG-63细胞，培养24 h完全贴壁后，更换培养基，分别添加DDP（5 μmol/L）、GEN（160 μmol/L）和HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）继续培养24 h，弃去培养基，用PBS轻微震荡洗2遍，然后采用0.25%的胰酶消化MG-63细胞，将消化收集的细胞以2000 rpm转速离心5 min，弃去上清液，分别用50 mmol/mL的膜联蛋白V（Annexin-V）和碘化吡啶（PI）溶液1 mL混悬，在暗室于37℃静置30 min，用DMEM细胞培养液混悬3次，采用流式细胞仪进行检测，实验用激发波为488 nm，而实验用发射波530 nm[8]。实验重复3次，取平均值进行统计分析。
1.7 Western blotting法检测HNPG对骨肉瘤MG-63细胞凋亡相关蛋白表达的影响
取对数期生长的MG-63细胞，培养24 h完全贴壁后，更换培养基，添加不同浓度的HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）后，继续培养24 h，用冰PBS轻微震荡洗MG-63细胞3次，用无菌滤纸条洗干净残余PBS液体后，加入PMSF裂解细胞并提取蛋白，取30 μg MG-63细胞蛋白，采用SDS-PAGE凝胶电泳分离，转膜，再用5%脱脂牛奶-TBST室温摇床封闭PVDF膜2 h，在37℃条件下用一抗孵育PVDF膜3 h，二抗孵育PVDF膜1 h，ECL激发PVDF膜上荧光，X线片压片，经显影定影后，用Imange J 2200软件分析处理[9]。
1.8 统计学方法
采用SPSS 21.0统计学软件对所有实验数据进行分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HNPG对骨肉瘤MG-63细胞增殖抑制的影响
取不同浓度的HNPG（0.625、1.25、2.5、5、10、20和40 μmol/L）分别作用于骨肉瘤MG-63细胞24 h，发现HNPG对细胞的增殖抑制率随浓度增加而增加，其中HNPG浓度在1.25～20.00 μmol/L范围之间抑制作用显著，不同浓度的HNPG对骨肉瘤MG-63细胞的增殖抑制率与NS组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图1A。选取2.5、5.0、10.0 μmol/L的HNPG为研究对象，发现HNPG对骨肉瘤MG-63细胞增殖抑制呈时间依赖性，其中5.0、10.0 μmol/L HNPG在12、24、48 h時间段对MG-63细胞的抑制率分别为（21.6±3.2）%、（45.2±4.6）%、（50.4±5.2）%，较NS组的（0.40±0.02）%显著升高，不同组的HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）在12、24、48 h时间段对MG-63细胞的抑制率组间比较，差异有统计学意义（P<0.05），HNPG作用MG-63细胞24 h的IC50为（4.8±0.6）μmol/L;其中5 μmol/L的 HNPG 对骨肉瘤MG-63细胞增殖抑制作用与5 μmol/L DDP（43.8±4.8）%或160 μmol/L GEN（44.2±5.0）%相当，差异无统计学意义（P>0.05）。见图1B。
2.2 HNPG对骨肉瘤MG-63细胞迁移的影响
取对数期生长的MG-63细胞，分别经DDP（5 μmol/L）、GEN（160 μmol/L）、HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）继续培养24 h，划痕愈合率分别为（39.27±3.24）%、（37.84±3.08）%、（52.91±2.64）%、（38.24±2.48）%和（7.26±0.39）%，较NS组的（71.23±4.62）%显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。HNPG各组之间，差异有统计学意义（P<0.05）;其中5 μmol/L的HNPG组与160 μmol/L的GEN或5 μmol/L DDP组细胞划痕愈合率相当，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1、图2。
2.3 HNPG对骨肉瘤MG-63细胞侵袭的影响
取对数期生长的MG-63细胞，分别经DDP（5 μmol/L）、GEN（160 μmol/L）、HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）继续培养24 h，细胞侵袭率分别为（42.72±2.93）%、（48.54±3.17）%、（23.30±1.38）%、（44.66±2.06）%和（87.39±4.05）%，较NS组的（0.34±0.03）%显著增高，差异有统计学意义（P<0.05）。HNPG各浓度组之间两两比较，差异有统计学意义（P<0.05）;其中5 μmol/L的HNPG组与160 μmol/L的GEN或5 μmol/L DDP组细胞侵袭率相当，差异无统计学意义（P>0.05）。见封三图6。
2.4 HNPG对骨肉瘤MG-63细胞周期的影响
取对数期生长的MG-63细胞，分别添加DDP（5 μmol/L）、GEN（160 μmol/L）、HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）继续培养24 h后，FMC检测发现MG-63细胞G1期比率增高，细胞G1期分别为（79.05±3.24）%、（77.77±4.08）%、（69.23±2.64）%、（78.65±3.48）%和（87.26±4.79）%，较NS组的（64.40±2.02）%显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。HNPG各组之间，差异有统计学意义（P<0.05）;其中5 μmol/L的HNPG组与160 μmol/L的GEN或5 μmol/L DDP组细胞G1期相当，差异无统计学意义（P>0.05）。见图3。
2.5 HNPG对骨肉瘤MG-63细胞凋亡的影响
取对数期生长的MG-63细胞，分别添加DDP（5 μmol/L）、GEN（160 μmol/L）、HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）继续培养24 h后，MG-63细胞凋亡率分别为（22.74±1.52）%、（22.08±1.71）%、（10.41±1.17）%、（24.63± 2.12）%和（34.40±3.16）%，较NS组的（2.75±0.20）%显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。HNPG各濃度组凋亡率之间两两进行比较，差异有统计学意义（P<0.05）;其中5 μmol/L的HNPG组与160 μmol/L的GEN或5 μmol/L DDP组细胞凋亡率相当，差异无统计学意义（P>0.05）。见图4。
2.6 HNPG对骨肉瘤MG-63细胞线粒体凋亡途径相关蛋白的影响
取对数期生长的MG-63细胞，分别添加不同浓度HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）继续培养24 h后，提取MG-63细胞蛋白并检测其平均相对灰度值，结果显示HNPG各浓度组蛋白表达平均相对灰度值与NS组比较，p53和bax蛋白表达随浓度增大而增大，差异有统计学意义（P<0.05）。与NS组比较，MG-63细胞bcl-2蛋白表达下调，差异有统计学意义（P<0.05）。见图5。
3 讨论
肿瘤细胞的异常增殖、迁移和侵袭是恶性肿瘤的重要表征，肿瘤细胞的异常增殖，致使瘤体组织压迫、浸润和侵袭周围组织的范围和强度增大，远处转移机会增多，释放入体内的有害物质增多;肿瘤细胞发生迁移，转移到其他部位，继续破坏器官组织;同时肿瘤细胞会发生局部浸润、侵袭，破坏组织结构，严重威胁患者的身心健康，因此抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，是肿瘤治疗的首要举措和衡量指标[10-11]。化疗是骨肿瘤的重要治疗举措之一，化学药物不仅可以抑制肿瘤细胞增殖，还可以杀死肿瘤细胞，使患者的无瘤生存期延长，极大改善了患者生活质量[10]。在临床化疗药物的基础上，通过改变药物化学结构，提高药物的生物吸收度和生物学性状，增加药物对肿瘤细胞增殖抑制率是当前的研究热点[11]。本研究将不同浓度的HNPG作用于对数期生长的骨肉瘤MG-63细胞，结果显示HNPG在体外对骨肉瘤MG-63细胞增殖、迁移和侵袭有显著的抑制作用，与其先导化合物GEN及DDP抗肿瘤效果相似[2-3]，提示HNPG作为一种抗肿瘤物质，极具研究价值。
细胞增殖必须依次经过G1、S、G2、M期，同时细胞在增殖过程任何一期进程减慢、停滞、加速均可能引起疾病的发生[12]。细胞周期的进展，受周期素、周期依赖性激酶、周期依赖性激酶抑制因子、细胞周期检测点等因素的调控[13]。细胞周期检测点包括DNA损伤检查点、DNA复制检查点、染色体分离检查点和纺锤体组装检查点，各检查点所处的位置和功能各异，其中DNA损伤检查点备受关注;当位于G1/S交界的DNA损伤检查点探测和获得DNA受损的信号后，则由效应器中断细胞周期进程，将细胞阻滞于G1期，并启动DNA修复，以保证DNA的质量[14]。凋亡是细胞在诱导凋亡的相关因素作用下，启动信号转导，凋亡基因接受死亡信号后按预定程序启动合成执行凋亡所需的多种酶而引发的一种程序性死亡，凋亡在疾病发生发展中具有积极的意义[15]。本研究结果显示，经不同浓度的HNPG作用下MG-63细胞增殖、迁移和侵袭受到抑制，伴随细胞周期G1期比例和细胞凋亡率显著增高，提示HNPG对MG-63细胞增殖、迁移和侵袭的抑制，可能与其引起细胞周期G1期阻滞，进而诱导凋亡密切相关，与Song等[16]报道的GEN抑制MG-63细胞增殖和诱导凋亡的效果及其分子生物学机制相似，但HNPG的生物活性显著高于GEN。
p53蛋白具有诱导细胞凋亡和抑制增殖的作用，其主要在G1/S期交界处发挥检查点的功能，当其发现线粒体DNA损伤时，通过刺激周期依赖性激酶抑制因子表达引起G1期阻滞，并启动DNA修复，如修复失败直接激活bax凋亡基因或下调bcl-2抗凋亡基因表达，启动细胞凋亡程序，将可能演变为癌细胞消灭在萌芽状态[17-18]。bcl-2和bax蛋白存在于线粒体的双层磷脂酶上，二者共同作用调控线粒体膜内外物质转运，当bcl-2和bax蛋白表达比例失调，导致线粒体内物质转运异常，进而引起细胞功能障碍[19-20]。本研究结果显示，经不同浓度的HNPG作用于MG-63细胞后，细胞周期阻滞于G1期，细胞凋亡率显著增高，细胞G1期阻滞和凋亡诱导可能与HNPG上调p53、bax蛋白表达，下调bcl-2蛋白表达相关，与Song等[16]报道的GEN抑制MG-63细胞增殖和诱导凋亡的效果与分子生物学机制相似，但HNPG的生物活性显著高于GEN。
综上所述，HNPG在体外可显著抑制骨肉瘤MG-63细胞增殖、迁移和侵袭，其分子生物学机制可能是引起细胞DNA损伤，激活细胞内p53蛋白表达，阻滞细胞于G1期，进而上调bax蛋白，下调bcl-2蛋白表达，启动细胞内预存程序性死亡基因，诱导细胞凋亡所致。然而HNPG在体内是否抑制肿瘤细胞生长增殖，以及HNPG与其他传统的抗肿瘤药物是否有协同作用，需要进一步深入研究。
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（收稿日期：2020-12-05）
