陈观木生 许丽梅 贾良良 何晓娟 李慧 叶蕻芝 李西海
【摘 要】 骨关节炎以关节软骨退变为病理特征，长链非编码RNA（lncRNA）在其病理过程中起重要的调控作用。lncRNA折叠成独特的构象能与RNA、DNA以及蛋白质互相作用，从转录过程、细胞核结构、转录因子、miRNA和mRNA转录后的调控4个方面影响基因表达，从而调控软骨细胞的功能、软骨基质的代谢、软骨下骨及滑膜细胞，影响关节软骨的退变。随着lncRNA的结构和功能不断被揭露，其调控骨关节炎软骨退变的机制会被阐释得更加具体，为临床上治疗骨关节炎提供新的靶点。
【关键词】 骨关节炎；lncRNA；软骨退变；机制
骨关节炎（osteoarthritis，OA）是生物力学与生物因素相互影响，主要包括关节周围的力学环境、自身激素的代谢水平、软骨细胞的凋亡、相关细胞因子，及基质金属蛋白酶（MMPs），引起关节生物力学紊乱而产生的病变。其病理是一种生物学重建的过程，表现为关节软骨退行性病变和关节边缘、软骨下骨骨质增生，目前缺乏有效的治疗手段[1]。OA生物化学上的特征主要是软骨基质中的可聚蛋白聚糖含量减少，其浓度、组成比例和分子链出现变化，胶原纤维减少和排列发生异常，大分子物质的合成和降解增多。长链非编码RNA（lncRNA）是长度超过200个核苷酸的RNA分子，不能编码蛋白质，但能在RNA水平上行使功能、进行基因调控和表观遗传修饰，其在软骨基质的生成和代谢、滑膜炎、软骨细胞自噬及凋亡中具有重要的调控作用[2]。本文通过查阅国内外相关文献，初步探讨lncRNA调控关节软骨退变的机制，为OA的治疗和研究提供一个新的方向。
1 lncRNA的生物功能与特点
lncRNA是非编码RNA的一个亚类，长度超过200 nt，具有跨物种的低保守性、组织特异性表达等特点，并非没有具体功能[3-4]。lncRNA基因在基因组内有不同的位置，可分为位于内含子区的lncRNA、基因间区的lncRNA、天然反义链lncRNA[5]。lncRNA除了没有开放阅读框外，其他结构与mRNA相似，其一级序列保守性较弱，但二级、三级结构为高度保守的区域，它可以借助不同的结构来发挥各种功能，通过折叠成独特的空间构象，并与RNA、DNA以及蛋白质进行生化作用，调控基因表达，对特定功能的发挥具有重要意义[6]。lncRNA空间结构的稳定性较低，可迅速产生调节作用，为机体提供较蛋白质而言更为灵敏的调控。人类基因组中具有编码蛋白质功能的不到2%，而高等真核生物基因组中约91%的序列，在生物体生长发育的各个阶段转录成为非编码RNA[7-8]，lncRNA在调控骨关节软骨退变的过程中发挥的重要作用，是医学界研究的热点问题[9]。
2 lncRNA对关节软骨退变的调控
核内lncRNA与细胞质内lncRNA作用机制不同，因碱基互补配对，核内lncRNA通过顺式作用（对邻近基因）及反式作用（远端位点）影响蛋白质与核酸的相互作用，抑制或者促进靶基因的表
达[10]。细胞质内lncRNA与相同染色体位点以及独立基因座的转录物互补，通过碱基配后，能对其进行翻译调控。lncRNA还能通过竞争性内源性RNA（ceRNA）即miRNA海绵，发挥调控作用[11]。lncRNA能够作为信号、诱饵、引导、支架，参与基因的调控，具体调控机制主要分为四个方面，其可能通过调控转录因子、转录过程、对miRNA和mRNA进行转录后的调控，以及对细胞核结构进行调控，完成对关节软骨退变的调控。
lncRNA通过转录因子进行调控：lncRNA与转录因子结合后，可以提高转录因子对目标DNA片段的亲和力，促进下游基因转录。lncRNA也可以抑制转录因子与DNA的结合，导致下游基因转录被抑制，如lncRNA GASS（growth arrest-pecific 5）
和PANDA（promoter of CDKN1A antisense）可与
转录因子直接结合，竞争性抑制转录因子结合DNA靶序列。lncRNA还可以抑制转录因子向核内穿梭，从而抑制下游轉录过程。
lncRNA对转录过程进行调控：lncRNA与RNA聚合酶Ⅱ结合后，抑制RNA聚合酶与DNA结合的生物功能，产生抑制转录的作用，如lncRNA Airn能直接干扰转录激活，使胰岛素样生长因子2受体（IGF2R）表达沉默。lncRNA通过结合编码基因的上游启动子区域，干扰转录前起始复合体的生成，对转录进行抑制。
lncRNA对miRNA和mRNA进行转录后的调控：一些lncRNA可利用细胞内的剪切作用，产生非成熟miRNA，部分lncRNA是miRNA的前体或宿主[12]。lncRNA竞争性结合miRNA，由此减少miRNA与靶向mRNA结合，此过程称为lncRNA诱导的miRNA沉默。lncRNA也能竞争性结合mRNA，与特异性mRNA的5'端结合，促进mRNA结合翻译因子，从而促进mRNA翻译。lncRNA与特定mRNA的3'端特异性结合，降低mRNA稳定性并促进mRNA降解，抑制mRNA功能，从而达到调控软骨退变的目的[13]。
lncRNA对细胞核结构进行调控：lncRNA可以形成染色质复合体，对组蛋白进行修饰，抑制或加强修饰过后染色质区域的转录活性。真核生物的细胞中DNA和组蛋白形成八聚体，在此状态下的DNA无法执行转录功能，lncRNA在核小体的重塑过程中，影响DNA从核小体上松解，参与了转录的调控。在细胞分裂间期，lncRNA通过亚核结构域，也对转录产生影响。
2.1 lncRNA调控软骨细胞功能的机制 软骨细胞是软骨中唯一存在的细胞，软骨细胞分布在软骨基质中，对软骨的完整性及软骨的负重功能发挥作用，其增殖、凋亡、自噬、分泌等功能对OA进程影响较大。正常情况下，软骨细胞的凋亡与增殖有序地进行，若过度凋亡，则将破坏内环境稳态，使软骨功能下降[14]。lncRNA与软骨细胞关系密切，如1ncRNA HIT表达变化会影响软骨细胞分化功能，lncRNA HOTAIR敲低后可抑制MMP-1、MMP-3、
MMP-9生成，还能明显降低软骨细胞凋亡，其为炎性因子与软骨破坏之间的桥梁。lncRNA Dnm3os影响软骨细胞的增殖及分化，是维持软骨细胞的新陈代谢、保证软骨细胞分化的物质基础。而PACER、CILinc01、CILinc02在OA软骨细胞内表达显著异常，其参与了软骨细胞的炎症反应。各种炎症因子作用于软骨细胞，导致软骨细胞代谢、分泌紊乱，软骨细胞大量减少，成骨和破骨的平衡被打破。lncRNA DANCR能提升白细胞介素-6（IL-6）
和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达。IL-6可以激活淋巴细胞，进而调节免疫功能，诱导炎症反应，以致软骨细胞增殖能力减退。TNF-α为巨噬细胞产生的促炎因子，与多种IL表达呈正相关，其能促进软骨细胞释放一氧化氮、MMPs、血管性血友病因子裂解蛋白酶（ADAMTS）等炎症因子，参与OA的发展。lncRNA HOTTIP为HOXA基因远端转录本的反义RNA，借助弯曲及成环而接近HOXA基因簇其他位点，吸引KMT2A/MLL复合体，推动H3K4me3在HOXA基因簇中定位，使染色质活化，增进同源异形基因的表达[15]。整合素α1是位于软骨细胞上的跨膜受体之一，具有介导细胞内外信息传递的作用，也是软骨内成骨过程中的正向调节蛋白，在OA患者的关节软骨中HOTTIP的表达上调，HoxA13的表达下调，整合素αl的合成受到抑制，关节软骨退变速度加快[16]。随着OA病情的发展，含有大量的细胞内丝状物和溶酶体样结构的软骨细胞渐渐取代正常软骨细胞，软骨细胞受损后不能继续分泌胶原纤维，修复功能减弱，导致关节软骨进一步退变，表面呈裂隙性磨损、糜烂、形成溃疡，而外力作用会加重这一过程，最后因反复摩擦，软骨表面破坏，软骨下骨显露[17]。
2.2 lncRNA调控软骨基质代谢的机制 软骨基质的代谢平衡保障了软骨组织的正常功能，在OA的病程中，软骨基质中的蛋白多糖含量减少，其浓度、组成比例和分子链也发生变化[18]。软骨基质降解的直接原因是MMPs、聚蛋白多糖酶、基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）、成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）、FGF-18、FGF-8等物质的分泌出现异常[19]。MMPs主要由成纤维细胞、炎性细胞、上皮细胞、内皮细胞分泌，Ca2+、Zn2+等辅助构成[1]。OA时，MMPs通过自身激活及细胞因子诱导合成，OA患者滑膜里MMPs的表达水平明显高于正常人，如MMP-13能破坏Ⅱ型胶原蛋白，参与软骨代谢过程，其在OA时高表达[20]。MMPs可以降解胶原蛋白、蛋白聚糖、纤连蛋白和层黏连蛋白等多种软骨基质的组成成分，其可使关节软骨纤维构架遭到破坏，包绕胶原纤维的分子筛滤过功能减弱，炎性因子可直接攻击原本在细胞外基质包绕下的软骨细胞。MMPs及TIMP失衡，加快了胶原纤维网的裂解，加速了软骨的退变。lncRNA-CIR能够加速软骨基质的降解，使软骨内平衡被打乱，导致OA的发生，而将lncRNA-CIR沉默后，MMP-13
和ADAMTS-5的表达明显下调，软骨组织中胶原蛋白和聚糖增多，基质降解酶含量降低，減慢了软骨退变的速度[21]。lncRNA MSR是miRNA 152的竞争性内源RNA，其能抑制TMSB4的表达，促进MMPs的表达，加速软骨基质的降解。lncRNA的下游信号分子，如聚蛋白多糖酶是通过Glu373-Ala374酶切位点对软骨中蛋白聚糖进行降解，可以破坏整个蛋白聚糖分子，对软骨的完整性及生理功能损害较大。IGF-2能促进软骨细胞的功能分化，调节软骨基质的合成，而IGF-2的表达受到lncRNA-H19的调控，因此lncRNA可以调控IGF-2的表达，影响软骨基质的合成，发挥对OA病理的调节作用[21]。一种lncRNA能从多个方面调控软骨退变，如H19衍生出的miRNA-675能够促进HIF-1α表达，使其在有氧环境中的降解减少，其不仅能减少软骨基质的破坏，还能促进软骨细胞分泌软骨基质，同时起到保护软骨基质和调节软骨细胞的双重作用。lncRNA可直接与mRNA特异性结合，促进mRNA翻译或者降解，由此影响下游信号分子，改变软骨细胞外基质破坏和软骨组织坏死的进程，起到调控关节软骨退变的作用[22]。
2.3 lncRNA调控软骨下骨的作用机制 正常软骨下骨包括关节软骨的钙化层及骨皮质层，其能吸收部分应力、缓冲震荡、保持关节形态，还可向软骨输送营养物质、清除软骨的代谢产物。软骨下骨和软骨的联系极为紧密，两者形成了一个动态承重结构，关节承受的应力绝大部分通过软骨下骨缓冲，软骨下骨和软骨任何一方发生病变，都能影响对方的功能[23]。在OA早期，软骨下骨的结构重塑加快软骨损伤，而软骨下骨硬化则会加重软骨退变。软骨下骨的成骨细胞能分泌细胞因子，刺激软骨细胞朝着肥大细胞的方向分化，肥大细胞可释放MMPs，加速OA进程。lncRNA DANCR位于人的第4号染色体上，在关节软骨损伤修复中发挥重要的调控作用，其可以竞争性结合CTNNB1来调控下游miR-214[9]。miR-214是调控成骨转化因子，OA时，在软骨下骨中异常表达，miR-214可以通过调控成骨细胞及破骨细胞活性而参与软骨下骨的骨重塑过程[24]。Wnt信号通路在软骨生成、调节软骨细胞表型以及维持基质的完整性方面有重要作用，可以延长软骨细胞生命周期且抑制其分化为肥大细胞[25]。lncRNA DANCR能调控Wnt通路，软骨细胞中Wnt通路活性改变后，会对软骨下骨生长板中破骨细胞的活性产生影响，导致软骨下骨硬化、关节边缘骨赘形成[26]。TGF-β是诱导间充质干细胞聚集到骨吸收位点的耦合因子，异常TGF-β信号通路能诱导软骨下骨形成骨岛，抑制TGF-β信号传导可以延缓软骨下骨的病理进展，在TGF-β异常表达的情况下，软骨下骨异常骨重塑。软骨下骨中骨细胞及骨祖细胞数目与活性TGF-β呈正相关[27]。lncRNA-AV310809能够调控Wnt2/β-catenin信号通路，促进TGF-β诱导的腹膜间皮细胞上皮间质转分化过程，故存在lncRNA通过Wnt2/β-catenin信号通路lncRNA调控软骨下骨的可能性[28]。
2.4 lncRNA调控滑膜细胞的机制 关节内滑膜组织被视为干细胞储存器，关节软骨发生损伤时，关节内滑膜组织可移行到缺损处，与其他局部细胞一起完成组织修复，滑膜间充质干细胞在这过程中发挥关键性作用[29]。lncRNA DANCR上游启动子存在NF-κB以及P-STAT3的转录结合位点，与CTNNB1 mRNA的表达联系密切，而CTNNB1 mRNA直接编码β-catenin，DANCR可能为滑膜间充质干细胞向软骨细胞增殖和分化的关键调控位点[30]。Wnt/β-catenin信号通路为经典的Wnt信号通路，Wnt是启动蛋白，而β-catenin为该信号通路的枢纽，其在OA时出现上调，Wnt/β-catenin被激活后，能促进OA的发展[1]。DANCR在滑膜间充质干细胞向软骨细胞增殖分化的过程中，借助Wnt/β-catenin信号通路可加强软骨细胞的增殖与分化，DANCR充当此过程中的始动环节，通过miRNA达到调控目的[31]。在OA早期，滑膜内的血管广泛增生，导致大量血管内炎症介质渗出，在细胞因子作用下，产生滑膜炎，随后出现滑膜细胞增生的病理变化，积液渗出常常伴随出现，最终滑膜增厚且纤维化，致使软骨退变。在OA滑膜细胞内，前列腺基因表达印迹（PCGEM1）的表达明显增多，抑制miR-770的表达水平，减少了滑膜细胞的凋亡、自噬，以及促进滑膜细胞增殖，lncRNA中的PCGEM1可以通过抑制miRNA的表达水平，从而调控滑膜细胞，影响关节软骨的退变。
3 展 望
目前，OA的治疗是通过改善关节内炎症、矫正不科学力线等达到缓解临床症状的目的，难以阻断及逆转OA病理的发展[32]，lncRNA可通过调控软骨细胞的功能、软骨基质的代谢、软骨下骨及滑膜细胞，影响关节软骨的退变，是研究OA新治疗手段的关键点。中药复方具有多靶点的作用特点，在OA的治疗上具有独特的优势，进一步阐明lncRNA调控骨关节软骨退变的机制，为探讨中药复方的多靶点效应提供新的思路，同时利用lncRNA的表观遗传干预能力，为研制出OA的靶向治疗药物提供新的切入点。
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收稿日期：2018-01-17；修回日期：2018-05-02
