新基因功能的研究方法设计实验,研究一新基因功能.简述流程.

基因功能的研究思路主要包括:1。基因的亚细胞定位和时空(发育期或梯度药物处理浓度,不同组织/器官)表达谱;2。基因在转录水平的调控(可以通过genome walking PCR或通过已有的资源库寻找该基因的启动子等转录调控区域,通过单杂交或ChIP等技术,寻找该基因的转录调控蛋白)3。细胞生化水平的功能研究(也就是蛋白蛋白作用复合体的寻找验证,具体方法有酵母双杂交,GST pulldown,co-IP,BRET,FRET,BiFc等等,对该基因的表达产物做一个细胞信号转导通路的定位)4。gain-of-function & loss-of-function:也就是分别在细胞和个体水平,做该基因的超表达和knockdown(或knockout),从表型分析该基因的功能。功能研究应从完整的分子-细胞-个体三个层次研究,综合分析。关于基因的表达和定位,可以这样去做：1。mRNA水平检测基因表达：选择表达目的基因的组织/细胞（发育不同时期、机体不同部位、加处理因素。。。）,提取RNA,反转录,做RT-PCR或real time RT-PCR,检测基因的表达情况/变化。（或者以northern blot、Rnase protection assay方法,检测基因的mRNA表达情况/变化。）2。蛋白质水平检测基因表达：选择相应的组织/细胞,以Western blot、免疫组化（OR免疫荧光)检测目的蛋白的表达。3。检测目的蛋白的细胞定位：将目的基因克隆至带荧光标签（如GFP）的表达载体,在适合的模式细胞中表达,在活细胞中观察蛋白的细胞定位。