氮蓝四唑NBT法测超氧化物歧化酶的具体步骤

氮蓝四唑（NBT）法测定超氧物歧化酶（SOD）活力 一、原理 超氧物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2,可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2,从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料；水稻或小麦叶片 （二）仪器设备：1。高速台式离心机；2。分光光度计；3。微量进样器；4。荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5。试管或指形管数支。（三）试剂 1。0。05mol/L 磷酸缓冲液（pH7。8）；2。130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称1。9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；3。750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0。06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml,避光保存；4。100μmol/L EDTA－Na2溶液：称取0。03721gEDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5。20μmol/L 核黄素溶液：称取0。0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。三、实验步骤 1。酶液提取 取一定部位的植物叶片（视需要定,去叶脉）0。5g于预冷的研钵中,1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆,加缓冲液使终体积为5ml。取1。2ml于1000rpm下离心20min,上清液即为SOD粗提液。2。显色反应 取5ml指形管（要求透明度好）4支,2支为测定管,另2支为对照管,按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0。05mol/L 磷酸缓冲液1。5130mmol/L Met溶液0。313mmol/L 750μmol/L NBT溶液0。375μmol/L 100μmol/L EDTA－Na2液0。310μmol/L 20μmol/L 核黄素0。320μmol/L 酶液0。052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0。25总体积3。0混匀后将1支对照管置暗处,其它各管于4000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致,温度高时间缩短,低时延长）。3。SOD活性测定与计算 至反应结束后,以不照光的对照管做空白,分别测定其它各管的吸光度。四、结果计算 已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示,按下式计算SOD活性。SOD总活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0。5×W×Vt) 上式中,SOD比活力＝SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位／mg蛋白表示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积（ml）Vt测定时样品用量（ml）W样鲜重（g）蛋白质含量单位为：mg蛋白／g鲜重。