乙肝抗原抗体检测实验的主要步骤

医学微生物学实验指导
　　实验十一 乙型肝炎抗原抗体检测
　　（Assay For Antigens and Antibodies of Hepatitis B Virus）
　　用RIA和ELISA法检测病人血清中的HBV抗原抗体是目前临床上诊断乙型肝炎最常用的检测方法。主要靠检测HBsAg、HBcAg、HBeAg及其相应抗体,由于HBcAg在血清中不易检出,故通常只检测HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe及抗-HBc（俗称‘两对半’）。其中HBsAg的检测最为重要,可发现无症状携带者,是献血员筛选的必检指标。这里介绍ELISA法。
　　HBV抗原抗体的血清学指标与临床关系较复杂,必须对几项指标同时分析,还必须结合临床及肝功能综合评价,才有助于临床诊断和治疗。
　　【目的要求】
　　了解和熟悉乙型肝炎的检测方法及原理。
　　【临床资料】
　　患者,男,13岁,未婚,于2周前出现厌食症状,胃口差,怕油腻,伴有乏力和全身不适,曾拟诊断“消化不良”进行治疗,未见好转。病程中患者睡眠差,小便黄,大便无特殊。平素健康良好,预防接种史不详,半年前曾因车祸致股骨骨折在私人诊所进行手术治疗,术中输血200ml。体格检查：体温：37。6℃,巩膜黄,肝肿大有压痛及叩痛。脾肋肿大。余正常。
　　实验室检查：血常规：白细胞（WBC）：3。5×109/L,其中淋巴细胞50%；血液生化示：丙氨酸氨基转移酶（ALT）：105u/L（连续监测法）天门冬酸氨基转移酶（AST）：90u/L（连续监测法）,血清白蛋白（A）：30g/L,血清球蛋白（G）：40g/L,A/G=0。75；
　　问题：
　　最有可能引起该病的病原体是什么?应进行什么检测?
　　【检测程序】
　　取患者血液→ 离心得患者血清标本→ ELISA法检测乙肝‘两对半’→ 结果判定→ 发报告。
　　【原理】
　　1． 夹心法
　　（1）双抗体夹心法：如HBsAg、HBeAg试剂盒。
　　将抗-HBs（或抗-HBe）联接（包被）到聚苯乙烯微量反应板上,加入被检血清标本,若血清中含有HBsAg（或HBeAg）,则在微量反应板孔内形成抗原抗体复合物,再加入酶标记的抗-HBs（或抗-HBe）与复合物中的HBsAg（或HBeAg）结合,然后加入底物,酶催化底物显色,根据显色的程度进行HBsAg（或HBeAg）的定性或定量判定。
　　（2）双抗原夹心法：如抗-HBs试剂盒。
　　用HBsAg包被微量反应板,加入被检血清标本,再加入酶标HBsAg,加底物显色,用以检测血清中是否有抗-HBs。
　　（3）竞争法：如抗-HBe试剂盒
　　将抗-HBe结合于固相载体上,然后同时加入被检血清标本和中和试剂（含有一定滴度的HBeAg）,如果被检标本中含有抗-HBe则和固相载体上的抗-HBe竞争结合HBeAg,被检标本中抗-HBe的含量越高,竞争结合的HBeAg越多,而与固相载体上的抗-HBe结合的HBeAg量越少,加入酶标抗-HBe与已经结合到固相载体上的HBeAg量越少,加入底物显色的颜色越浅；反之,颜色则越深。
　　（4）竞争抑制法：如抗-HBc试剂盒。
　　将抗-HBc结合于固相载体上,然后加入HBcAg,形成抗原抗体复合物,再加入被检血清标本和酶标抗-HBc。被检血清标本中若无抗-HBc,则酶标抗-HBc与复合物中的HBcAg结合,被检血清标本中若含有抗-HBc,则被检血清标本中的抗-HBc与复合物中的HBcAg结合,竞争性地占去了酶标抗-HBc与复合物中HBcAg结合的机会,是酶标抗-HBc与复合物中HBcAg结合的量减少。加入底物显色,根据颜色的深浅判定结果。
　　【材料】
　　1． 标本：患者血液
　　2． 试剂盒：乙型肝炎病毒HBsAg检测试剂盒；
　　乙型肝炎病毒抗-HBs检测试剂盒；
　　乙型肝炎病毒HBeAg检测试剂盒；
　　乙型肝炎病毒抗-HBe检测试剂盒；
　　乙型肝炎病毒抗-HBc检测试剂盒；
　　3． 其他：微量移液器,吸头,37℃恒温箱,洗涤液,吸水纸,离心机等。
　　注：各试剂盒的反应板上已经包被好相应的抗原或抗体。
　　【方法】
　　1． 患者血液离心得待检血清标本。
　　2． 打开试剂盒,取出微量反应板。在微量反应板上依次作好标记HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc各三孔。
　　3． 在第一排中,依次向HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc孔加入100μl待检血清标本。
　　4． 在第二排中,分别依次加入HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc 1滴阳性对照血清。
　　5． 在第三排中,分别依次加入HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc 1滴阴性对照血清。
　　6． 分别向各孔加入相应的酶结合物1滴,振荡摇匀,置37℃恒温箱恒温30分钟。
　　7． 取出后用洗涤液洗板5次,每次冲洗后拍干。
　　8． 加入底物A、B各1滴,置置37℃恒温箱恒温15分钟。
　　9． 取出后加终止液1滴。
　　10．根据颜色判定结果。