图位克隆:如何利用图位克隆将基因定位与染色体

1.如何利用图位克隆将基因定位与染色体

加强顶层设计与摸着石头过河相结合，需要在改革中处理好各种关系。一是把制度安排与经验总结有机结合起来。改革的实质是要破除各种体制机制弊端，形成系统完备、科学规范、运行有效的制度体系，从而进一步解放思想、解放和发展社会生产力、解放和增强社会活力，必须在总结实践经验的基础上，促进制度完善，凸显制度活力。二是把国家指导与地方创新有机结合起来。我国的改革已经进入攻坚期和深水区，要坚定改革的正确方向，建立制度体系，必须加强国家对全面深化改革的规划和指导。而实现改革目标，需要地方创新和基层探索，创造性地解决各地、各行业、各个领域的实际问题。三是政府推动与市场决定有机结合起来。经济体制改革是全面深化改革的重点，核心问题是处理好政府与市场的关系。这也是处理好顶层设计与摸着石头过河关系必须遵循的原则。改革的顶层设计本身就是一种政府推动改革，激发改革动力，加大改革力度，制定改革措施，加快改革进程等，依赖市场体系。

2.图位克隆目的基因有哪些原理？

在利用分子标记技术对目的基因进行精细定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，从而构建目的基因区域的物理图谱。

3.图位克隆法的图位克隆的技术环节

异花授粉植物分子标记的检出率较自花授粉植物的高。培育特殊的遗传群体是筛选与目标基因紧密连锁的分子标记的关键环节。即除了目标基因所在座位的局部区域外，基因组DNA序列的其余部分都是相同的，在这样的材料间找到的多态性标记才可能与目标基因紧密连锁。目标基因的近等基因系(NILs)是符合条件的一类群体。近等基因系是指几乎仅在目标性状上存在差异的两种基因型个体，一般凡是能在近等基因系间揭示多态性的分子标记就极有可能位于目标基因的两翼附近。Martin等(1993)就是用RAPD技术分析番茄PTO基因的近等基因系而获得了与该基因表现共分离的分子标记，以该分子标记为探针筛选基因组文库而实现了染色体登陆。利用AFLP技术分析玉米CMS-S型雄性不育的恢复基因及近等基因系，已获得与目标基因紧密连锁的分子标记并以其用作分离RF3基因的探针。欲获得最大遗传信息量的F2群体，BSA)以筛选目标基因所在局部区域的分子标记。其原理是将目标基因的F2(或BC1)代分离体的各个体仅以目标基因所控制的性状按双亲的表型分为两群，形成两个DNA混合池(如抗病和感病、不育和可育)。由于分组时仅对目标性状进行选择，因此两个DNA混合池之间理论上主要在目标基因所在局部区域的差异，近等基因系法、分离群体分组分析法再结合AFLP等强有力的分子标记技术使人们能够在短时间内从数量众多的分子标记中筛选出与目标基因紧密连锁的标记。这种策略在尚未构建遗传图谱的物种中也是可行的。比较基因组研究主要是利用相同的DNA分子标记(主要是cDNA标记和基因克隆)在相关植物种之间进行遗传或物理作图，比较这些标记在不同物种基因组中的分布特点，揭示染色体或染色体片段上的基因及其排列顺序的相同(共线性)或相似性(同线性)，并由此对相关物种的基因组结构和起源进化进行分析。存在生殖隔离的不同植物物种之间在标记探针的同源性、拷贝数及连锁顺序上都具有很大程度的保守性。Moore等(1995)同时对水稻、小麦、玉米、谷子、甘蔗及高粱等6种主要禾本科物种的基因组进行了比较作图研究，结果表明其中基因组最小的水稻居于中枢的位置，即这些禾本科植物基因组的保守性可归结到水稻基因组的19个连锁区段上。由这19个区段可实现对所研究的全部禾谷类作物染色体的重建，并可构成一个禾谷类作物祖先种的染色体骨架。植物比较基因组的研究成果表明，包括禾本科、十字花科、豆科植物及一些树木的基因组在基因组成和基因排列顺序上都存在很大程度的一致性。基因组成和排列顺序的一致性非常完好。（1）遗传图谱的构建染色体的交换与重组是遗传图谱构建的理论基础，如果一个基因与两侧最近的分子标记距离均在2 cM以上，就需要作精细的遗传图谱。需要进行若干步的染色体步行，精细的遗传图谱对图位克隆显得非常重要，而增加遗传图谱上的分子标记数目是精细作图的基础。在一个已知区域内增加分子标记有两种方法，第一种方法是整合已有的遗传图谱。如将生理、生化、分子标记图在同一区域内整合在一起，另一种方法是寻找新的分子标记。精细作图的发展速度超过了动物的同类研究，这主要是因为在植物上可很方便地建立和维持较大的分离群体，并建立了几种不同的检测标记间连锁关系的统计软件。过去被公认为难以开展遗传作图的木本植物，如今也涌现出了许多密度可观的分子标记连锁图，已有越来越多生物的遗传图谱趋于饱和，这就为生物的物理图谱的构建奠定了基础。（2）物理图谱的构建由于分子标记与目标基因之间的实际距离是按碱基数(bp)来计算的，它会因不同染色体区域基因重组值不同而造成与遗传距离的差别，所以物理图谱是真正意义上的基因图谱。物理图谱的种类很多，从简单的染色体分带图到精细的碱基全序列都是物理图谱。最为常用的物理图谱有限制酶切图谱、跨叠克隆群和DNA序列图谱等。限制酶切图谱是用几种限制性内切酶消化DNA，通过电泳检查限制性片段长度的办法确定它们的排列顺序；可以利用稀有切点限制性内切酶和脉冲电脉。制作跨叠克隆群则需具有一定容量的大片段基因组文库。比较各个克隆的插人片段，将它们排列成与原来在染色体中的顺序一样的连续克隆群，即跨叠克隆群(也叫重叠克隆群)。跨叠克隆群的制作方法有三种：其基本原理是利用基因组某一区域特有的或与所需分离的目标基因紧密连锁的DNA分子标记为探针筛选大片段基因组文库，需要通过染色体步行来填补。该技术从分离大片段阳性克隆群的左、右末端人手，以它们为探针再次筛选基因组文库，获得新的克隆即为沿着染色体向前走了一步，这一方法能利用各种分子标记扫描文库，准确得到携带分子标记的阳性克隆，是构建跨叠克隆群的首选策略。包括STS、RAPD、AFLP和Alu-PCR等已被广泛应用于跨叠克隆群的构建。STS策略是利用已知核酸序列，从两端合成两个与其配对的引物，利用PCR进行扩增，理论上讲具有相同扩增带型的克隆，也可以说共享一个或数个STS位标的克隆肯定是跨叠的。是人类基因组计划所采用的主要策略之一。另一重要的基于PCR的策略是A1u-PCR技术，该技术利用人类基因组的Alu重复序列，合成一对特异性引物，进行PCR扩增，然后以PCR产物为探针，从文库中筛选出阳性克隆。当与限制性内切酶物理图谱结合使用时，就可以比较精确地排列出阳性克隆的重叠顺序。其原理是首先对随机克隆的DNA选定一个6碱基识别位点的限制性内切酶消化，经标记后DNA片段用另一个4个碱基识别位点的限制性内切酶消化，用序列分析胶分离这些片段，这些指纹图谱数据经计算机处理后。可高效地克隆25~35 kb的DNA片段。当要克隆大片段DNA时。需要YAC作载体，可将300~1000 kb的DNA片段克隆：以YAC为载体可以构建高等植物的完整基因组文库。后来又陆续发展了BAC、PAC等几种以细菌为寄主的载体系统。图位克隆在理论上适用于任何物种，一个基因往往长达几个到几十个kb，只有容纳大片段插入子克隆载体，才能携带完整的基因。柯斯质粒从λ噬菌体改造而来，由于采用质粒的复制子，柯斯质粒克服了包装的限制，柯斯质粒还是不敷应用，人工染色体在细胞周期中可以正常复制，人工染色体的插入片段可达2 Mb左右，能够覆盖完整的真核基因。最早发展的人工染色体是酵母人工染色体（YAC）。Burke等得到了能够克隆大片段DNA的YAC载体，证明YAC可以构建高等生物的完整基因组文库。而且难以与酵母自身的染色体分开。后来陆续发展了P1、BAC、PAC等几种以细菌为寄主的载体系统。值得一提的是进展一直缓慢的哺乳动物人工染色体(MAC)和人类人工染色体(HAC)也已取得突破性进展。找到与目标基因紧密连锁的分子标记(最好分布在基因两侧)和鉴定出分子标记所在的大片段克隆以后，逐渐靠近目标基因，以该克隆的末端作为探针筛选基因组文库，鉴定和分离出邻近的基因组片段的克隆，再将这个克隆的远端末端作为探针重新筛选基因组文库。直到获得具有目标基因两侧分子标记的大片段克隆或重叠群。如果目标基因所在区域已经完成分子作图，就有一套现成的顺序排列的大片段克隆可以利用。获得目标基因。当必须经过一个无法克隆的片段时(如对寄主无害)，当克隆的一端是重复序列时，发展了染色体登陆、跳步和连接等方法。染色体登陆是找出与目标基因的物理距离小于基因组文库插入片段的平均距离还小的分子标记，通过筛选文库直接获得含有目标基因的克隆，完全避开染色体步行的过程。染色体跳步—连接是使用一个识别位点很少的随机一个识别位点很多的酶构建跳步文库和连接文库。跳步文库的插入片段是大片段克隆末端经过双酶切的部分，由同样的文库进行克隆。连接文库的插入片段是由切点较少的酶产生的，具有切点较少的那个酶的识别位点。筛选和鉴定目的基因是图位克隆技术的最后环节，找到与目的基因紧密连锁的分子标记并鉴定出分子标记所在的大片段克隆后，接着是以该克隆为起点进行染色体步行，逐渐靠近目的基因。当遗传连锁图谱指出基因所在的特定区域时，获得目的基因。在与目的基因紧密连锁的分子标记及大插入片段基因组文库都具备的情况下，就可以以该分子标记为探针通过菌落杂交，蓝、白斑挑选的方式筛选基因组文库而获得可能含有因的基因的阳性克隆。在用覆盖目的基因区域的大片段基因组DNA克隆筛选区域特异的cDNA后，仍需对目的基因编码的cDNA作进一步证实。现有证实目的基因编码的cDNA克隆的方法有：1) 精细作图来证实某候选基因克隆与目标性状共分离；

4.图位克隆的原理

用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的,1) 首先找到与目标基因紧密连锁的分子标记;4) 以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库;5) 用获得阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群;6) 通过染色体步行、登陆或跳跃获得含有目标基因的大片段克隆;7) 通过亚克隆获得含有目的基因的小片段克隆;

5.什么是图位克隆

图位克隆(Map - based cloning) 又称定位克隆(positional cloning),用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的,无需预先知道基因的DNA 顺序,也无需预先知道其表达产物的有关信息,1) 首先找到与目标基因紧密连锁的分子标记;2) 用遗传作图和物理作图将目标基因定位在染色体的特定位置;3) 构建含有大插入片段的基因组文库(BAC 库或YAC) ;4) 以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库;5) 用获得阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群;6) 通过染色体步行、登陆或跳跃获得含有目标基因的大片段克隆;7) 通过亚克隆获得含有目的基因的小片段克隆;8) 通过遗传转化和功能互补验证最终确定目标基因的碱基序列。

6.图位克隆的存在的问题

1、需要有精确的遗传图谱2、遗传图谱上离目的基因很近的分子标记在物理图谱上还相距甚远3、高等植物基因组极其复杂，存在大量重复序列，在实际操作中会遇到走不动的难题。

7.pCAMBIA1304的多克隆位点图

看吧就是这个。