rna提取步骤:从RNA抽提到制成cDNA的全过程

从RNA抽提到制成cDNA的全过程

一).构建cDNA文库：以生物细胞的总 mRNA 为模板，用反转录酶合成互补的双链 cDNA ，然后接到载体上，转入到宿主后建立的基因文库就是 cDNA 文库。1、mRNA的提取及其完整性的确定1） 总 RNA 的提取RNA 提取方法：APGC法或NP-40或应用试剂盒提取总RNA2）mRNA的分离高等真核生物 mRNA 分子的 3' 端均有 poly(A) 尾，将总RNA通过寡聚（DT）纤维柱分离mRNA或利用磁珠法制备纯mRNA。在某些情况下，裂解细胞后用蔗糖梯度来制备mRNA-核糖体复合物作为提取mRNA的替换途径。3） mRNA 的纯化 ①按照大小对总 mRNA 进行分级，主要用琼脂糖凝胶电泳和蔗糖密度梯度离心法进行分级；②多聚核糖体的免疫学纯化法，这是利用抗体来纯化合成目的多肽的方法。4）mRNA 完整性的确定确定 mRNA 完整性的方法有三种：① 直接检测 mRNA 分子的大小；② 测定 mRNA 的转译能力；③ 检测总 mRNA 指导合成 cDNA 第一链长分子的能力。2、 cDNA 的合成和克隆1） cDNA 第一链的合成用亲和层析法得到 mRNA 后，根据 mRNA 分子的 3' 端有 poly (A) 尾结构的原理，用 12~20 个核苷酸长的 oligo （ dT ）与纯化的 mRNA 混合， oligo （ dT ）会与 poly (A) 结合作为反转录酶的引物，反转录反应的产物是一条 RNA-DNA 的杂交链。 oligo （ dT ）结合在 mRNA 的 3' 端，因此合成全长的 cDNA 需要反转录酶从 mRNA 分子的一端移动到另一端，有时这种全合成难以达到，尤其是 mRNA 链很长时，为此建立了一种随机引物法合成 cDNA 。随机引物是一种长度为 6~10 个核苷酸，由 4 种碱基随机组成的 DNA 片段。与 oligo （ dT ）仅与 mRNA 3' 端结合不同，它们可以在 mRNA 的不同位点结合。随机引物法合成的产物也是 RNA-DNA 的杂交体。把 cDNA 克隆到载体中之前，必须把这种杂交体中的 RNA 转变成 DNA 链，即形成双链 DNA 分子。2）. 双链 cDNA 的合成合成 cDNA 第二条链有两种方法。一种方法是利用 cDNA 第一链的 3' 末端常常出现发夹环的特征，这种发夹结构是反转录酶在第一链末端“返折”并且进行复制第一链的结果，它为合成 cDNA 第二链提供了有用的引物。用这种方法合成的双链 cDNA 在一端有一个发夹环，可以用单链特异的 S1 核酸酶切去。但是 S1 核酸酶的处理，常常会“修剪 ” 过多的 cDNA 顺序，使 cDNA 丢失了 mRNA 5' 端的部分顺序。 另一种方法是用大肠杆菌的 RNase H 进行修饰。 RNase H 能识别 RNA-DNA 杂交分子并把其中的 RNA 切割成短的片段，这些 RNA 短片段仍与 cDNA 第一链结合，可被新合成的 DNA 所取代。新合成的 DNA 存在切口，用 DNA 连接酶把这些切口连接在一起形成一条完整的 DNA 链。 RNase H 法优于 S1 核酸酶法，它能获得包括 mRNA 5' 端全部或绝大部分的更长顺序 cDNA 分子。3） 将 cDNA 重组到载体上 合成的 cDNA 与载体 DNA 进行连接一般有 3 种方法：① 借助于末端转移酶的 3' -OH 端合成均聚物的能力，双链 cDNA 和线性化载体 DNA 的 3' -OH 端分别加上均聚核苷酸链；② 双链 cDNA 和线性化载体 DNA 分别用 Klenow 片段进行末端补平，然后用 T4 DNA 连接酶进行齐头连接，形成重组体；③ 通过粘性末端连接。4）. 转化重组的载体 DNA 分子在一定条件下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。当不同重组的 DNA 含有不同的 cDNA 基因时，整个转化子含有来自 mRNA 群体的各种 cDNA 基因，这样的转 化子群体构成该 mRNA 全部遗传信息的 cDNA 基因文库。5）. 目的 cDNA 克隆的鉴定用于从 cDNA 文库中筛选和鉴定目的 cDNA 的方法主要有 3 种：① 核酸杂交 ② 免疫学杂交检测 ③ cDNA 同胞选择

血清RNA提取方法

血清RNA提取，biog的具体操作步骤如下：1. 请自行准备：无水乙醇、无RNA酶1.5mL离心管。2. 取出洗涤液，按以下操作：a) 洗涤液A：b) 洗涤液B：9mL加入21mL无水乙醇；18mL加入42mL无水乙醇。c) 配制好的洗涤液如出现沉淀，摇匀后使用。3. 取无RNA酶的1.5mL离心管，4μLRNA Carrier混合均匀，再加入300μL 裂解液及20μL 消化液，漩涡震荡10秒，充分混匀，56℃水浴10 分钟至完全裂解。轻轻颠倒混匀，如有半透明悬浮物，不影响RNA的提取与后续实验。5. 将吸附柱放入收集管内，将760μL上述溶液转入吸附柱内，弃收集管内废液.6. 将剩余760μL溶液转移至吸附柱内，重复步骤5。加500μL 洗涤液A至吸附柱内，加500μL 洗涤液B至吸附柱内，弃收集管内废液。9. 将吸附柱放回收集管内，离去残留的洗涤液。10. 取出吸附柱，放入新的无RNA酶的1.5 mL 离心管内，加入30-50μL 洗脱液，000 rpm 4℃ 离心2 分钟，收集RNA溶液。11. -70℃保存，或直接用于下一步实验。

TRIzol法提取RNA每个步骤的作用是什么？

溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；

RNA提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些

一).构建cDNA文库：以生物细胞的总 mRNA 为模板，用反转录酶合成互补的双链 cDNA，然后接到载体上，转入到宿主后建立的基因文库就是 cDNA 文库。1、mRNA的提取及其完整性的确定1） 总 RNA 的提取RNA 提取方法：APGC法或NP-40或应用试剂盒提取总RNA2）mRNA的分离高等真核生物 mRNA 分子的 3'将总RNA通过寡聚（DT）纤维柱分离mRNA或利用磁珠法制备纯mRNA。裂解细胞后用蔗糖梯度来制备mRNA-核糖体复合物作为提取mRNA的替换途径。主要用琼脂糖凝胶电泳和蔗糖密度梯度离心法进行分级；②多聚核糖体的免疫学纯化法，这是利用抗体来纯化合成目的多肽的方法。4）mRNA 完整性的确定确定 mRNA 完整性的方法有三种：③ 检测总 mRNA 指导合成 cDNA 第一链长分子的能力。2、 cDNA 的合成和克隆1） cDNA 第一链的合成用亲和层析法得到 mRNA 后，oligo （ dT ）会与 poly (A) 结合作为反转录酶的引物，反转录反应的产物是一条 RNA-DNA 的杂交链。因此合成全长的 cDNA 需要反转录酶从 mRNA 分子的一端移动到另一端，有时这种全合成难以达到，为此建立了一种随机引物法合成 cDNA。随机引物是一种长度为 6~10 个核苷酸，由 4 种碱基随机组成的 DNA 片段。端结合不同，它们可以在 mRNA 的不同位点结合。随机引物法合成的产物也是 RNA-DNA 的杂交体。把 cDNA 克隆到载体中之前，必须把这种杂交体中的 RNA 转变成 DNA 链，2）. 双链 cDNA 的合成合成 cDNA 第二条链有两种方法。一种方法是利用 cDNA 第一链的 3'末端常常出现发夹环的特征，这种发夹结构是反转录酶在第一链末端“并且进行复制第一链的结果，它为合成 cDNA 第二链提供了有用的引物。用这种方法合成的双链 cDNA 在一端有一个发夹环，可以用单链特异的 S1 核酸酶切去。但是 S1 核酸酶的处理，另一种方法是用大肠杆菌的 RNase H 进行修饰。RNase H 能识别 RNA-DNA 杂交分子并把其中的 RNA 切割成短的片段，用 DNA 连接酶把这些切口连接在一起形成一条完整的 DNA 链。RNase H 法优于 S1 核酸酶法，-OH 端合成均聚物的能力，-OH 端分别加上均聚核苷酸链；然后用 T4 DNA 连接酶进行齐头连接，形成重组体；③ 通过粘性末端连接。4）. 转化重组的载体 DNA 分子在一定条件下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。

血块中提取RNA的步骤

血液（全血，也就医学上说的外周血）中RNA的含量很低，一般是处理抗凝血液。像以上全血的RNA提取有两种思路：1）直接处理抗凝的全血，处理的体积血液体积有限，一般1ml Trizol处理100ul血液，最多不超过200ul.2) 先去除血液中的红细胞分离出其中的白细胞（即淋巴细胞），然后提取白细胞的RNA。此方法的缺点：

RNA的提取方法

1、酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎细胞，然后用酚和酚-氯萃取，所得DNA大小为100-150kb2、甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA可得DNA200kb左右。用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DNA沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。4、异丙醇沉淀法：仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶状态）5、表面活性剂快速制备法：用Triton X-100A或NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。6、加热法快速制备：可用于PCR反应。7、碱变性快速制备：先用NaOH作用20分钟，含少量DNA。DNA提取原则：

怎样从总RNA中提取mRNA?原理是什么？

大多数真核细胞mRNA的3’端通常具有由20-30个腺苷酸组成的polyA尾巴，寡聚胸腺嘧啶脱氧核糖核苷（OligoT）可以与之配对结合，这就是提取mRNA最基本的原理。亲和素标记磁珠（生物素和亲和素间具有高度亲和力）。实验时生物素标记的OligoT与mRNA的polyA高效杂交形成复合体，此复合体又与标有亲和素的磁珠结合。用磁性分离架就可以将这堆复合物分离出来。最后用无RNase去离子水将mRNA从复合物中洗脱下来即可。寡聚dT纤维素柱层析法的大致流程：总RNA流经寡聚dT纤维素柱时，带polyA尾的mRNA被特异地结合在柱上。